高效液相色谱

1、 色谱联用技术介绍色谱联用技术介绍 -HPLC-MSHPLC-MS的简单介绍 液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用是以HPLC为分离手段，MS为检测器的一门综合性分析技术，它集HPLC的高分离能力与MS的高灵敏度、极强的定性专属特异性于一体的技术。它以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作。可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等），分析范围广，而且不需衍生化步骤。HPLC-MS实例分析液液质联用分析锦绣杜鹃叶黄酮类成分质联用分析锦绣杜鹃叶黄酮类成分 黄酮类化合物 一级质谱中大多以准离子分子形式存在，有少量碎片离子。二级质谱中碎片信息则较少，

2、主要峰的质谱图见图 3 7。根据分析液相中的色谱峰与总离子流图中所对应的离子峰的质谱信息，并结合相关文献的报道，对锦锈杜鹃 HPLC 分离出的5 个主要峰进行分析，推断出其可能的结构 。 质谱负离子模式的总离子流图与 356 nm 波长下紫外色谱图基本吻合，但总离子流图的基线噪声较大。结果分析结果分析高效液相色谱的基本原理1903年提出、19691970年开始发展原理：以液体为相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的检测技术：采用高效固定相、高压泵、高灵敏检测器实现：分析

3、速度快、分离效率高、操作自动化分析。高效液相色谱的工作原理通过高压泵，将流动相抽入柱子1通过进样器，注入样品混合物23.由于混合物中各组分性质不同，因而它们在柱内移动速度不同而逐渐分离。4.通过检测器检测，得到组分的电信号并进行放大；记录仪将放大的电信号以图形形式记录下来。1.高压高压一般：一般：150300kg/cm2 ,甚至：甚至：500kg/cm2为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压2.高速高速两相间交换千分之几秒，分析时间较经典法少很多(几分几十分钟)通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内可完成3 高效高效气相：2000塔板/米，液相：5000塔板/米可选择固定相和流

4、动相以达到最佳分离效果，比工业蒸馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍4.高灵敏高灵敏度度紫外检测器：109g数量级荧光检测器：1011g(百万分之几），试样量小（几微升）5.高选择高选择性性可分析在性质上极为相似化合物（手性化合物、同位素、同分异构、空间异构） 高效液相色谱特点 相同点相同点不同点不同点1.都是重要的分离、分析手段 2.气相的基本理论（塔板理论、定性定量方法）3.基本术语（色谱参数、色谱图、色谱柱效）1.应用范围：气相：易挥发、热稳定液相：不易挥发、热不稳定 但具有一定溶解性化合物，不适合气体。2.流动相作用：气相：运载样品，不影响色 谱分离液相：运载样品，参与、影响色谱分离，且

5、起主要作用。3.分析样品：气相：破坏样品，不能回收。液相：不破坏样品，能回收。液固吸附色谱（LSC)（ 利用样品分子在固定相上吸附性能差异而分离）液液分配色谱（LLC）（利用样品分子在两相中分配系数不同导致溶解度不同而分离）（键合相色谱 60）离子交换色谱（IEC）（利用样品分子的电荷性、导电性不同，导致对固定相的亲合力不同而分离）体积排阻色谱（SEC)（利用溶质分子大小不同导致对固定相的渗透力不同而分离）高效液相色谱分类 上述每种色上述每种色谱类型均可进一谱类型均可进一步分为多个不同步分为多个不同色谱方法。这些色谱方法。这些方法可用于分析方法可用于分析分离，也可用于分离，也可用于制备分离，各

6、色制备分离，各色谱方法在相关领谱方法在相关领域应用互相补充域应用互相补充。高效液相色谱的仪器系统一、泵系统 通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50-500)105Pa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性极小。最重要的是系统密封性能好。 目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优、缺点。高效液相色谱的仪器系统二、进样系统六口旋转进样阀示意图六口旋转进样阀示意图 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（

7、约530cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。工作原理：手柄位于取样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。高效液相色谱的仪器系统三、色谱柱三、色谱柱 色谱柱是液相色谱的色谱柱是液相色谱的心脏部件心脏部件，它包括柱管与，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜固定相两部分。柱管材料有玻璃

8、、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5 530cm30cm，内径为内径为4 45mm5mm，凝胶色谱柱内径，凝胶色谱柱内径3 312mm12mm，制备往，制备往内径较大，可达内径较大，可达25mm 25mm 以上。以上。一般在分离前备有一一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其

9、中固定相，保和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离的性能不受影响证分离的性能不受影响。高效液相色谱的仪器系统四、检测系统功能：连续地将色谱柱中流出的组分随时间 变化的情况，转变成大小不同的电信 号输入到记录仪中，得到色谱图。按检测方式不同，分为：总体性质检测器（通用型） 示差折射检测器、电导检测器溶质性质检测器（选择型） 紫外（最常用，对大部分有机物有响应）、荧光、电化学检测器高效液相色谱的基本原理五、梯度洗涤 类似于GC中的程序升温。已成为现代高效液相色谱中不可缺少的部分。气动放大泵 梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂

10、的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。梯度洗提可以分为两种：a.低压梯度（也叫外梯度）：在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合后，再用一台高压泵输入色谱柱。b.高压梯度 ( 或称内梯度系统 ) ：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按设定的比例送入梯度混合室，混合后，进入色谱柱。液固吸附色谱原理: 流动相是液体，固定相是极性吸附剂（如硅胶、氧化铝）。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附，由于不同官能团样品具有不同极性，因而对固定相的吸附能力不同。极性越大，吸附能力强；极性

11、越低，吸附能力越弱而导致分离。分离对象：官能团有差别的不同类型化合物 官能团不同极性不同吸附强度不同几何异构体 几何异构体空间位置不同吸附强度不同液液吸附色谱定义: 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。 达到平衡时，服从于高效液相色谱计算公式：原理： 溶质分子X在固液两相中存在分配平衡K=XS/Xm，不同的溶质在两相中有不同的分配系数K，因而在两相中有不同的溶解度。在固定相中溶解度大，tR；在移动相中溶解度大， tR。 IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子

12、与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：X-（溶剂中）+ (树脂-R4N Cl-)=（树脂-R4N X-)+ Cl- 凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。 离子交换色谱离子交换色谱空间排阻色谱法 空间排阻色谱法以凝胶(gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在

13、凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。 制备型高效液相色谱常见问题和解决办法a.待分离成分呈单一主峰待分离成分呈单一主峰b.不易分开的两组分不易分开的两组分c.目的组分含量少目的组分含量少待分离成分呈单一主峰不易分开的组分目的组分少的举例1环境中有机氯农药残留量分析环境中有机氯农药残留量分析固定相：薄壳型硅胶(37 50mm)流动相：正己烷流速：1.5 mL/min色谱柱：50cm´2.5mm（内径）检测器

14、：差示折光检测器可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析2.、稠环芳烃的分析、稠环芳烃的分析稠环芳烃多为致癌物质。固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水 100%甲醇；线性梯度淋洗,2%/min流速：1mL/min柱 温：50 ºC柱压：70 ´104 Pa检测器：紫外检测器3阴离子分析阴离子分析双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3250mm),流动相：0.003molL-1 NaHCO3 / 0.0024 molL-1Na2CO3,流量138 mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在350 ppm。高效液相色谱与实验相结合与自己实验结合： 利用高效液相色谱仪测定废水中阴离子表面活性剂的含量。此法简单、快速、准确，二次污染少，平行样相对