组织培养实验教案

1、实验一 组培实验室常用洗涤灭菌方法一、实验目的和要求：植物组织培养是一项十分细致的工作，为了保证植物外植体不受污染，第一关就是要对各种器皿进行清洗和消毒，使它们保持无菌状态，做这些工作同样有一套科学的方法和需要熟练的技巧，因此每个学生必须学好这套基本功。在进行各类具体的组培实验前，首先了解组培室的结构及主要设备的用途和性能是十分必要的，总体上的了解有利于以后各实验的进行以及正确的使用各种仪器和设备。通过实际操作，学会洗涤剂的配制和各种器皿的清洗和灭菌方法。二、仪器设备：天平、烧杯、容量瓶、量筒、移液管、培养瓶、烘箱三、试剂：过氧化氢、高锰酸钾、漂白粉、次氯酸钠、酒精四、实验步骤：1. 讲解实验

2、室的构建情况。2. 讲解内部仪器设备的名称及作用。3. 组培实验室常用器械的洗涤和灭菌。（一）玻璃器皿的洗涤1. 新购置的玻璃器皿的洗涤（学习、操作）因有游离碱性物质，使用前先用 1%稀盐酸浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。2. 已用过玻璃器皿先将残渣除去；用清水洗净，再用热肥皂水或洗衣粉洗净，清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗一次，干后备用。3. 对一些不宜刷洗的玻璃器皿如：吸管，滴管及较脏的器皿等先用去污粉和去油剂刷洗，自来水冲干净后，晾干，再浸入硫酸重铬酸钾洗液中浸泡若干小时，用夹子取出在自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗 13 遍，稍晾不滴水后置于干燥箱内烘

3、干备用。4. 对带有凡士林，石蜡，或胶布的器皿选用特殊方法处理后，再用常规方法洗涤。带有凡士林的器皿须先用废纸把凡士林擦去，再用汽油擦洗干净，然后用热肥皂水煮沸半小时，刷洗后，自来水冲干净。若带有石蜡，可在玻璃器皿下垫几层废纸，放入 6070温箱中加热12 小时，待石蜡融化后，再用废纸反复擦 23 次即去石蜡再泡入洗衣粉的热水中洗干净最后用自来水冲洗，蒸馏水冲洗干净若有胶布粘着物，先用 70%酒精棉球擦数遍，溶解粘胶物，并用少许去污粉刷抺，再用洗衣粉煮沸半小时，刷洗干净，自来水冲洗，晾干，再泡入洗液。（二）金属器皿新购置金属器皿因其上有润滑油或防绣油，用蘸有四氯化碳（CCl4）布擦去油脂，再用

4、湿布擦净，干燥备用。二、灭菌（一）器皿和用具常用灭菌方法：1. 热压灭菌法（学习操作）将洗净的培养器皿，用具，用牛皮纸包好，放入高压消毒锅中，1.1 个大气压下灭菌 2030 分钟。2. 干热灭菌法洗净的玻璃器皿置于电热干燥箱中，15040 分钟或 120两小时，待冷却后使用。（二）无菌室灭菌（接种室、培养室）1. 紫外灯照射 40min 后，用新洁尔灭擦抺工作台，70%酒精擦拭超净工作台。2. 薰蒸（学习操作）用甲醛、高锰酸钾提前 13 天薰蒸密封房间方法 1：甲醛倒入蒸发皿加热，用量 10ml/m2。方法 2：甲醛（HCHO）与高锰酸钾（KMn4）以 10：1 比例混合。3. 接种前用 7

5、075%酒精喷雾，使飘在空气中的尘埃沉积下来。4. 用紫外光灯进行照射灭菌（波长 26502660A 最好）接种箱及用具 3040 分钟。实验二 MS培养基的制备及高压灭菌一、实验目的和要求：通过实验使学生认识掌握配置与保存培养基的基本技能。二、仪器设备：天平、烧杯、容量瓶、量筒、冰箱、电炉、高压蒸汽灭举锅、移液管、培养瓶、标签。三、试剂：待配各种培养基的组成成分、琼脂、蔗糖四、实验步骤：1.母液的称取2.生长调节剂的量取3.固化剂的称取4.蔗糖的称取5.定容6.调pH7.分装8.灭菌培养基母液的配制和保存 MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将

6、培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。大量元素(母液) mgLNH4NO3 33000 KNO3 38000 CaCl2·2H2O 8800 MgSO4·7H2O 7400 KH2PO4 3400微量元素(母液)KI 166 H3BO3 1240 MnSO4·4H2O 4460ZnSO4·7H2O 1720Na2MoO4·2H2O 50CuS

7、O4·5H2O 5CoCl2·6H2O 5铁盐(母液)FeSO4·7H2O 5560Na2-EDTA·2H2O 7460有机成分(母液)A肌醇 20000B烟酸 100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸 400以上各种营养成分的用量，除了母液为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。其中，母液、母液及母液的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。母液的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-

8、EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至5.5，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。MS培养基中还需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6苄基嘌呤(6BA)等植物生长调节物质，并且分别配成母液(0.1 mg/mL)。其配制方法是：分别称取这3种物质各10 mg，将2，4-D和NAA用少量(1 mL)无水乙醇预溶，将6BA用少量(1 mL)的物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶

9、解过程需要水浴加热，最后分别定容至100 mL，即得质量浓度为0.1 mg/mL的母液。配制培养液 用量筒或移液管从各种母液中分别取出所需的用量：母液为50 mL，母液、A和B各5 mL。再取2，4D 5 mL、NAA 1 mL，与各种母液一起放入烧杯中。配制培养液时应注意：在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂 用粗天平分

10、别称取琼脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。需要注意的是，在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.47.0)

11、测培养基的pH，一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/51/4。每1 000 mL培养基，可分装2530瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸(每块大小约为9 cm×9 cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤。1 码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再

12、放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。2放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶(以上物品都要用牛皮纸封口)，用牛皮纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔3灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 下，灭菌20 min。4灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固。最好放置1 d后再使用。实验三 胡萝卜愈伤组织的诱导实验内容：1胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制2 胡萝卜愈伤组织的诱导一、实验目的1. 通过本次实验，进一步熟悉配制培养基的流程

13、及操作中应注意的事项，学会设计和筛选胡萝卜愈伤组织诱导培养基配方。2. 通过本次实验，能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。二、实验原理、实验流程或装置示意图1. 实验原理（1）将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。（2）将胡萝卜的贮藏根（根的变态）表面消毒后切割成小块接种于愈伤组织诱导培养基上，诱导外植体脱分化产生愈伤组织。2. 实验流程配置胡萝卜愈伤组织诱导培养基 接种胡萝卜肉质根诱导愈伤组织产生实验结果观察记录三、实验设备及材料1. 实验用具和仪器冰箱、普通天平、三角瓶、果酱瓶、移液管、量

14、筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（pH5.47.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、棉线、电炉、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉等。酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台、恒温培养箱、100ml三角瓶、500或1000ml搪瓷杯、50ml量筒、1ml、2ml、5ml、10ml吸管等。2. 药品和试剂：MS培养基母液、常用试剂母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH、胡萝卜愈伤组织诱导培养基、无菌水、75酒精、0.1%HgCl2，、愈伤组织继代培养基、蒸馏水等。3

15、. 材料：胡萝卜肉质直根、处于脱分化进程中的胡萝卜愈伤组织四、实验方法步骤及注意事项1. 实验步骤：（1）胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配方及配制体积A、培养基配方设计：a根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。b确定培养基中各种激素的浓度及相对比例B配方：MS基本培养基 1mg/L 2,4-D0.5mg/L 6-BA0.7琼脂3蔗糖C配制体积：每小组配制0.5L，每人用50ml三角瓶分装5瓶，每瓶约装25ml培养基。(2)胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制步骤A. 药品及用具的准备B. 培养基配制a.根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（3.5g），放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液

16、后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。b.MS基本培养基配置：（配置前先检查各母液情况，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用）。大量元素母液：25ml；微量元素母液：2.5ml；铁盐母液：2.5ml；有机物母液：各2.5ml。0.5mg/L 2,4-D取1ml， 0.5mg/L 6-BA取2.5ml。混匀。c.待琼脂完全溶解后，加入规定用量的蔗糖（15g），继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，再加入所需用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），最后加蒸馏水至所需体积，即500ml。C.调节培养基的酸碱性至pH5.8培养基配制好后应立即进行pH值的调整。用精密pH试纸

17、测试。培养基若偏酸时用lmol·L-1 NaOH来调节，偏碱则可用lmol·L-1 HCl来调节。D.培养基的分装配制好的培养基要趁热分装，培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用棉线扎紧。本次实验中500ml分装到20个三角瓶，每人5瓶。E.培养基的灭菌培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kgf·cm-2或0.105 MPa （可在0.105 0.12MPa间，但不得超过0.14 MPa），温度121时保持1530 min左右即可。F.无菌蒸馏水和接种工具准备用果酱瓶装自来水，用不透气的封口膜封口灭菌后即为无菌水。接种

18、工具也是用纸包好灭菌。（3）接种前准备工作A外植体表面灭菌前的准备工作10mina 接种室的清洁和消毒以及超净工作台的开机和消毒：超净工作台消毒（75%酒精）, 紫外灯+风机 关紫外灯，并保持风机吹风状态；将各组的培养基，无菌水、解剖刀、镊子等操作工具放到超净台上，并进行消毒待用。b消毒溶液、无菌水、装材料的容器、解剖刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。c配置消毒溶液：1g HgCl2 +1000ml蒸馏水，配置成0.1%的HgCl2。（1000毫升的2份）B 实验材料的准备a 准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验材料；b 实验材料的修整、刷洗、冲洗； c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水冲净。每组12根胡萝卜，用试管刷和肥皂洗净，进行初次表面清洁；洗净后用干净的烧杯盛放，用小刀切成合适大小的4段（每人1段），转入超净台待用。（4）植物材料的表面灭菌和接种A. 操作人员洗手消毒B. 装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒C. 将待消毒的材料浸入75的酒精中10秒，取出转入无菌水冲洗干净。（酒精单独一个杯子装，消毒完毕转下一组使用）D. 将无菌水倒出，并倒入消毒剂（ 0.1 %HgCl2 ）并计时30分钟；（同一瓶子中操作即可，但注意不要碰到瓶口等关键部位）E. 到预定时间（30分钟）后，倒出消毒液，