植物组织培养33018324

1、植物组织培养 plant tissue culture繁 殖 技 术植物组织培养v基础知识 概念 历史 原理v实验技术 实验室组成 操作程序v发展技术v指植物的离体部分（包括任何器官、组织、指植物的离体部分（包括任何器官、组织、细胞或细胞或原生质体原生质体），在人工控制的），在人工控制的培养基培养基及环境条件及环境条件（温度及光照）下，得以生长（温度及光照）下，得以生长和和分化分化成完整植株的一种无菌培养技术。成完整植株的一种无菌培养技术。又称：植物离体培养又称：植物离体培养一、一、植物组织培养的概念植物组织培养的概念植物克隆植物克隆基础知识基础知识基础知识基础知识植物组织培养的概念植物组织培

2、养的概念植物克隆植物克隆植物组织培养的概念植物组织培养的概念优点： 繁殖系数大 繁殖快 去病毒，节省土地v二、植物组织培养的由来及发展二、植物组织培养的由来及发展1902年，德国科学家年，德国科学家G.Harberlandt从从高等植物取下气孔、表皮及叶肉组织放高等植物取下气孔、表皮及叶肉组织放在人工培养基上，虽然遭致失败，却启在人工培养基上，虽然遭致失败，却启发了植物组织培养的概念。并且，由他发了植物组织培养的概念。并且，由他提出了高等植物的提出了高等植物的每一个活细胞都具有每一个活细胞都具有分化全能性分化全能性totipotency。v1937年，美国科学家年，美国科学家White等人改进

3、了等人改进了培养基培养基，结果培养的细胞开始分裂，堆积成一团菜花状结果培养的细胞开始分裂，堆积成一团菜花状瘤状物，即瘤状物，即愈伤组织愈伤组织，但没能继续分化为根、，但没能继续分化为根、茎、叶等器官。后来研究发现，只有在培养基茎、叶等器官。后来研究发现，只有在培养基中加入适当比例的中加入适当比例的细胞分裂素细胞分裂素和和植物生长素植物生长素，愈伤组织才能分化出芽和根。愈伤组织才能分化出芽和根。愈伤组织愈伤组织培养基培养基v。v1958年，年，Steward由胡萝卜韧皮部组织诱出愈由胡萝卜韧皮部组织诱出愈伤组织，再由愈伤组织分化成小苗，证明了高伤组织，再由愈伤组织分化成小苗，证明了高等植物活细胞

4、具有分化全能性。等植物活细胞具有分化全能性。v。v1962年年Marshing和和Shong发明了发明了MS培养基培养基。v1967年年Maths发现白杨在组织培养过程中，产发现白杨在组织培养过程中，产生的化学物能抑制霉及细菌的生长。生的化学物能抑制霉及细菌的生长。Khanna和和Staba从悬浮或静止培养基中分离植物组织，发从悬浮或静止培养基中分离植物组织，发现其中具有抗微生物（抗菌剂活跃）活性者高现其中具有抗微生物（抗菌剂活跃）活性者高达百分之八十。达百分之八十。v1971年，年，Ra-jasekbar认为组织在不同情况下培认为组织在不同情况下培养，会产生不同的代谢产物以影响组织的生长。养

5、，会产生不同的代谢产物以影响组织的生长。.三、植物组织培养的原理三、植物组织培养的原理“细胞的全能性细胞的全能性”v植物每个植物每个体细胞体细胞具备与受精卵一样的全套遗传物质，具备与受精卵一样的全套遗传物质，但在完整植株植株上某一体细胞只是组织的一部分。它但在完整植株植株上某一体细胞只是组织的一部分。它受完整植株的控制，只承担某一小部分功能，表现一定受完整植株的控制，只承担某一小部分功能，表现一定形态。这是形态。这是某些基因受阻遏和控制某些基因受阻遏和控制，而只使极少数基因，而只使极少数基因发挥作用之故，但其发挥作用之故，但其遗传潜在表现能力并未丧失遗传潜在表现能力并未丧失。当植。当植物器官、

6、组织或细胞脱离完整植株后，就不再受到完整物器官、组织或细胞脱离完整植株后，就不再受到完整植株的控制。植株的控制。离体的器官、组织或细胞在适宜培养基和离体的器官、组织或细胞在适宜培养基和无菌的培养条件下，由于激活了基因，从而生长、增殖，无菌的培养条件下，由于激活了基因，从而生长、增殖，发育分化出组织和器官，直至形成完整植株。发育分化出组织和器官，直至形成完整植株。四、植物组织培养的应用 v在植物在植物快速繁殖快速繁殖和和脱毒脱毒上的应用上的应用v在植物在植物种质资源保存种质资源保存上的应用上的应用v在植物在植物育种育种上的应用上的应用单倍体育种单倍体育种胚胎培养胚胎培养细胞融合细胞融合基因工程基

7、因工程培养细胞突变体培养细胞突变体v培养过程中代谢产物的利用培养过程中代谢产物的利用v在遗传、生理、生化和病理研究上的应用在遗传、生理、生化和病理研究上的应用 一、组培设备 1、准备室、准备室 仪器和设备 ； 药品 实验技术实验技术1、准备室、准备室 仪器和设备 ； 药品 实验技术实验技术一、组培设备 2、接种室、接种室vl 仪器和设备 超净工作台、酒精灯、定时钟等vl 药品 酒精、次氯酸钠等上海和呈仪器制造有限公司 CO2培养箱3、培养室、培养室不锈钢培养架（组不锈钢培养架（组培专用灯）、光照培培专用灯）、光照培养箱养箱v4、练苗室AGlimpseofPlantTissueCulture获取

8、获取外植体外植体无菌接种无菌接种诱导愈伤组织诱导愈伤组织的形成的形成试管苗的形成试管苗的形成扩大培养扩大培养移栽移栽脱分化脱分化再分化再分化二、植物组织培养程序二、植物组织培养程序（一）、涉及的基本概念（一）、涉及的基本概念v1.外植体外植体explant : 用于植物组织培养的用于植物组织培养的离体材料离体材料称为称为外植体外植体 。v2.分化分化differentiation 细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而细胞在分裂过程中发生结构和功能上的改变，从而在在发育中形成各类组织和器官，发育中形成各类组织和器官，完成整个生活周期。完成整个生活周期。3.脱分化脱分化dedifferen

9、tiation将植物的根、茎、叶等器官进行离体培养时、这些将植物的根、茎、叶等器官进行离体培养时、这些器官中已分化的有特定结构和功能的细胞，将会逐渐器官中已分化的有特定结构和功能的细胞，将会逐渐丧失原有分化状态，而恢复细胞分裂机能，形成无组丧失原有分化状态，而恢复细胞分裂机能，形成无组织结构、无器官分化的薄壁细胞团。此时形成的薄壁织结构、无器官分化的薄壁细胞团。此时形成的薄壁细胞团称为细胞团称为愈伤组织愈伤组织.愈伤组织愈伤组织形成一种相对没有分化的形成一种相对没有分化的活的薄壁细胞团组成的活的薄壁细胞团组成的新生组织。新生组织。 3.再分化再分化redifferentiation新形成的愈伤

10、组织，经过一段时间的培养，新形成的愈伤组织，经过一段时间的培养，会产生一些分生细胞团，随后由它再分化为具会产生一些分生细胞团，随后由它再分化为具有特定结构和功能的组织或器官，如根和不定有特定结构和功能的组织或器官，如根和不定芽。芽。4.胚状体胚状体embroid对应于对应于胚胚embryo，在离体培养过程中产生一，在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。胚相同的结构。 5.培养基培养基medium人工配制的适合植物生长繁殖或积累代谢产人工配制的适合植物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，其中含有所必需的物的营养基质，其中

11、含有所必需的能源能源、碳源碳源、氮源、矿质元素、水和生长因素，但不同营养氮源、矿质元素、水和生长因素，但不同营养类型、不同种类的植物对营养元素的要求又有类型、不同种类的植物对营养元素的要求又有较大差异。较大差异。6.继代培养继代培养subculture愈伤组织在培养基上培养一段时期之后，便愈伤组织在培养基上培养一段时期之后，便因养分缺乏或本身分泌一种植物毒素，使它不因养分缺乏或本身分泌一种植物毒素，使它不能再生长，因此必须移入新的培养基。能再生长，因此必须移入新的培养基。二、植物组织培养程序二、植物组织培养程序1 1、配制半固体培养基、配制半固体培养基2 2、获取外植体、获取外植体3 3、 接

12、接 种种4 4、光、光 照照 培培 养养5 5、 移移 栽栽通过调节通过调节营养物质和植物生营养物质和植物生长调节剂长调节剂的适当配比的适当配比离体、消毒离体、消毒的植物器官、的植物器官、组织或细胞组织或细胞植物体植物体根、芽根、芽脱分化脱分化再分化再分化植物组织培养生理过程植物组织培养生理过程愈伤愈伤组织组织脱分化脱分化胚胚状状体体再分化再分化（二）具体流程简介（二）具体流程简介v实验开始啦实验开始啦v配制培养基配制培养基植物组织培养的培养基植物组织培养的培养基v无机营养物质：无机营养物质：植物所必需的大量元素及微量元素植物所必需的大量元素及微量元素v有机营养物质有机营养物质 含含N N物质

13、：包括维生素和氨基酸物质：包括维生素和氨基酸 碳源：碳源：2%5%2%5%的蔗糖的蔗糖 琼脂：起凝固支持作用琼脂：起凝固支持作用植物生长调节剂植物生长调节剂：（：（生长素，细胞分裂素）生长素，细胞分裂素）PHPH值：值：5.05.06.06.0 5.植物激素 生长素auxins ：IAA，IBA NAA，2,4-D 细胞分裂素cytokinin ： BA, KT，ZT(一)母液配制 Preparation Room(二)培养基配制Media Mixing母液、糖水混合 定溶加热调节pH值放冷放冷灭灭菌菌分装分装器皿及其他准备器皿及其他准备加热预溶琼脂+水凝固凝固接接种种v2、外植体选取与灭菌、

14、外植体选取与灭菌v选材考虑因素：选材考虑因素：取哪部分器官或组织最合适取哪部分器官或组织最合适部分器官或组织的生理状态，发育年龄部分器官或组织的生理状态，发育年龄取材季节取材季节材料大小材料大小外植体的两种类型：外植体的两种类型：A.带芽的外植体如茎尖和侧芽带芽的外植体如茎尖和侧芽B.分化的组织：茎段，叶，根，花瓣等分化的组织：茎段，叶，根，花瓣等v无菌操作间无菌操作间 超净工作台 v3、接种兰花嫩茎兰花茎尖外植体的消毒外植体的消毒选取嫩茎选取嫩茎 selection of the burgeonsv外植体表面灭菌外植体表面灭菌v从室外带回来的材料除去一些不必要的部从室外带回来的材料除去一些不

15、必要的部分洗去泥土然后用皂液或洗衣粉及消洗灵分洗去泥土然后用皂液或洗衣粉及消洗灵浸泡，冲洗，必要时可用软刷刷洗材料，然后浸泡，冲洗，必要时可用软刷刷洗材料，然后剪成适宜的大小，再行深灭菌。通过表面灭菌剪成适宜的大小，再行深灭菌。通过表面灭菌可清除许多杂菌，如在马蹄莲根茎的离体培养可清除许多杂菌，如在马蹄莲根茎的离体培养中，通过清洗根茎外植体的泥土，剥去外面几中，通过清洗根茎外植体的泥土，剥去外面几层包庇物，流水冲洗层包庇物，流水冲洗1小时，可把杂菌清洗掉小时，可把杂菌清洗掉60左右（左右（MerelLG,1998）。）。v外植体的深灭菌外植体的深灭菌通过外植体表面灭菌后，仍有一部分杂菌存通过外

16、植体表面灭菌后，仍有一部分杂菌存在于材料表面或内部，必须经过更深层次的的在于材料表面或内部，必须经过更深层次的的灭菌处理如加消毒药剂、抗生素、水浴、灼烧灭菌处理如加消毒药剂、抗生素、水浴、灼烧等措施才能获得不带菌的外植体。下面是几种等措施才能获得不带菌的外植体。下面是几种典型外植体的深灭菌处理程序。典型外植体的深灭菌处理程序。v外植体灭菌：外植体灭菌：要去除材料上的微生物，又不能伤及材料。要去除材料上的微生物，又不能伤及材料。v常用灭菌剂：常用灭菌剂：乙醇乙醇（70%75%）、）、次氯酸钠溶液次氯酸钠溶液（0.5%10%）、）、升汞升汞（0.1%1%）、抗生素类杀）、抗生素类杀菌剂等。菌剂等。

17、v一般可将材料冲洗干净后，放入一般可将材料冲洗干净后，放入70%酒精中数酒精中数秒，用无菌水冲洗后再放入升汞（秒，用无菌水冲洗后再放入升汞（110min）或次氯）或次氯酸钠中（酸钠中（530min）消毒。再用无菌水反复冲洗四、）消毒。再用无菌水反复冲洗四、五遍，可达到灭菌目的。五遍，可达到灭菌目的。不同植物不同部位都有各自不同植物不同部位都有各自的特点，即使同样的植物组织，由于栽培条件或季节的特点，即使同样的植物组织，由于栽培条件或季节不同，污染情况也不同。灭菌方式也有所差异。不同，污染情况也不同。灭菌方式也有所差异。可参可参照相似植物的灭菌或是通过实验得到最适灭菌方式。照相似植物的灭菌或是通

18、过实验得到最适灭菌方式。3、接种、接种有点外科医生的感觉有点外科医生的感觉取材、灭菌后接种取材、灭菌后接种修剪外植体修剪外植体 接种接种Inoculation 5、光照培养、光照培养(组培室组培室)4 4、增殖、增殖培养培养初代培养初代培养 外植体外植体初代培养初代培养 继代增继代增 殖殖生根苗驯化生根苗驯化 诱导生根诱导生根继继代代循循环环 返返回回蝴蝶兰Phalaenopsis生根苗卡特兰Cattleya生根苗石斛兰Dendrobium生根苗石斛兰(Dendrobium)瓶苗我们的小苗长大了我们的小苗长大了分化完全的百合小苗分化完全的百合小苗5、移栽、移栽植物细胞培养主要几种技术：植物细胞培养主要几种技术：1 1、组织培养、组织培养2 2、悬浮细胞培养、悬浮细胞培养3 3、原生质体培养、原生质体培养4 4、单倍体培养、单倍体培养 通过调节通过调节营养物质和生长调节剂营养物质和生长调节剂的适当配比，诱导愈的适当配比，诱导愈伤组织伤组织分化出芽和根的分生组织分化出芽和根的分生