山茱萸药材指纹图谱的研究

1、西北植物学报2004,24(10:19221928A ctaB ot.B orea l.-O cciden t.S in.文章编号:100024025(20041021922207山茱萸药材指纹图谱的研究王花红1,郭五保2,顾莹2,王吉吉之13(1陕西师范大学生命科学学院,西安710062;2陕西中医药研究院实验中心,西安710003摘要:以乙腈2磷酸梯度洗脱,用高效液相色谱法建立山茱萸药材的指纹图谱。用方法学考察,表明其精密度高,重现性好。实验测定多批样品图谱,共确定10个共有指纹峰,采用相关系数法计算不同样品指纹图谱之间相似度,结果表明指纹图谱相似度大小与药材品质有关。关键词:山茱萸;指纹

2、图谱;高效液相色谱中图分类号:Q946.91;R917文献标识码:AStud ies on f i ngerpr i n ts of M acroca rp ium of f icina leW AN G H ua2hong1,GUO W u2bao2,GU Y ing2,W AN G Zhe2zh i13(1Co llege of L ife Sciences,ShaanxiN o r m al U niversity,Shaanxi X ian710062,Ch ina;2Center of Experi m ent,ShaanxiA cade2 m y of T raditi onal

3、Ch inese M edicine,X ian710003,Ch inaAbstract:F ingerp rin ts of M acroca rp ium of f icina le w as estab lished by h igh perfo r m ance liqu id ch rom atogra2 p hy(H PL Cin the study.Gradien t m ob ile system w as app lied w ith aceton itrile2pho spho ric acid and the m ethodo logical exp eri m en

4、ts show ed h igh p recisi on and good rep eatab ility.T here are10comm on finger2 p rin t p eak s w ere iden tified after m any sam p les w ere deter m ined.T he si m ilarity am ong differen t sam p les w as com p ared by calcu lating co rrelati on coeffcien ts,w h ich w as co rrelated w ith the qua

5、lity of the herb. Key words:M acroca rp ium of f icina le(Sieb.et Zucc.N akai;fingerp rin ts;H PL C中药山茱萸(FRU CTU S CORN I是山茱萸科(Co rnaceae山茱萸属(M acroca rp ium植物山茱萸(M acroca rp ium of f icina le(Sieb.et Zucc.N akai的成熟干燥果肉,主产于我国陕西、浙江、河南等省,四川、安徽、山东、山西亦有栽培。山茱萸始载于神农本草经,为我国传统珍贵的中药材,以除去种子的果肉入药,味酸涩,性微温,为收敛性强

6、壮药,有补肝肾止汗的作用1。近代药理学研究表明,山茱萸不仅能抗炎杀菌2,还具有较好的调节免疫系统功能的作用35和显著的降血糖作用6,对艾滋病及癌症等也有一定的疗效7,8,药用价值较高,同时又是常用中成药“六味地黄丸”、“桃豆地黄汤”等的原料,中药生产用量和市场需求量大,具有广阔的开发前景。目前国内外对山茱萸的研究主要集中在其化学成分及药理作用的研究,缺乏综合评价和分析药材品质的方法和尺度,而山茱萸在长期的应用和栽培的过程中,种内产生很大变异,出现较多类型,同时因药材多由药农自己加工、且加工方法不同,导致药材质量存在一定差异,造成目前药源质量不稳定和市售药材质量无法正确评估的混乱局面。中药材指纹

7、图谱研究作为现代中药质量控制和鉴别的新兴技收稿日期:2003206220;修改稿收到日期:2004209203基金项目:国家“十五”攻关项目(2001BA701A35;陕西省陕南中药产业发展领导小组办公室(2003;陕西汉江药业集团股份有限公司资助作者简介:王花红(1979-,女(汉族。现在中国科学院植物研究所攻读博士,主要从事植物化学和分子生物学研究。术,为质量评价问题的解决提供了新的思路和方法。通过建立中药材指纹图谱可以全面反映中药材所含内在化学成分的种类和数量,进而反映中药材的质量,因而是中药材的一种新型的且有意义生产质量标准。本研究采用高效液相色谱法建立山茱萸药材指纹图谱,为山茱萸药材

8、的综合质量控制提供参考依据。1材料和方法1.1材料山茱萸(M acroca rp ium of f icina le(Sieb.et Zucc.N akai药材分别从陕西、河南、浙江、山西、四川、安徽等地采集或收集,所测样品详见表1。表1山茱萸指纹图谱研究样品表T able1T he samp les of fingerp rints of M.of f icinale样品号N o.of samp les产地P roducting area样品号N o.of samp les产地P roducting area1陕西佛坪200113陕西佛坪20022陕西佛坪200214陕西佛坪20023陕西佛

9、坪200215陕西佛坪20024陕西佛坪200216陕西佛坪20025陕西佛坪200217陕西丹凤20026陕西佛坪200318河南内乡20027陕西佛坪200319浙江临安20028陕西佛坪200320山西阳城药材公司购2002 9陕西佛坪200321安徽亳州药材公司购2002 10陕西佛坪200322四川安县药材公司购2002 11陕西佛坪200223药材市场商品200212陕西佛坪200224陕西陇县药材公司购20021.2方法1.2.1仪器与试剂仪器:w aters2690型高效液相色谱仪(四元泵,自动进样器,PDA检测器,M il2 len ium32色谱工作站。试剂:甲醇色谱纯美国

10、F ish ier试剂公司乙腈色谱纯美国F ish ier试剂公司水纯净水甲醇,磷酸分析纯标准品:熊果酸(U rso lic acid,74228701,中国药品生物制品检定所齐墩果酸(O leano lic acid,070929803中国药品生物制品检定所马钱素(L ogan in,2423980Sigm a公司1.2.2色谱条件色谱柱:K rom asil C18色谱柱(4.6×250mm,5m及其C18保护柱;流动相:乙腈20.4%磷酸水溶液梯度洗脱,梯度见表2;柱温:室温;流速:1mL m in;检测波长:210 nm;进样量:10L;1.2.3标准品溶液的配制精密称取熊果

11、酸标准品3.9m g,置10mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得0.39m g mL熊果酸标准储备液。精密称取齐墩果酸标准品3.2m g,置10mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得0.32 m g mL齐墩果酸标准储备液。表2指纹图谱流动相线性梯度表T able2T he linearity of mobile system of fingerp rints 时间T i m e(m in乙腈A cetonitrile(%0.4%磷酸0.4%H3PO4精密称取马钱素标准品4.1m g,置10mL容量瓶中,用30%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得0. 41m g mL马钱素

12、标准储备液。1.2.4样品溶液的制备精密称取山茱萸粗粉(40目1.00g,置25mL容量瓶中,加25mL甲醇,超声处理30m in,取出,过滤,并用10mL甲醇清洗滤纸,合并滤液,置蒸发皿浓缩,转移至5mL容量瓶中定容,过0.45m微孔滤膜后进样10L。2结果2.1空白试验吸取甲醇10L,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,结果见图1,表明空白无干扰。329110期王花红,等:山茱萸药材指纹图谱的研究 图1山茱萸指纹图谱空白对照F ig .1B lank contro l of fingerp rints of M .of f icinale图2山茱萸指纹图谱马钱素、熊果酸、齐墩果酸对照品H PL

13、 C 图F ig .2L oganin ,OA ,UA standards of fingerp rints of M .of f icinale2.2对照试验分别吸取各对照品溶液10L ,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,见图2。2.3图谱测定时间的确定取样品溶液,注入高效液相色谱仪,记录120m in 色谱图,结果表明100m in 后无有意义峰出现,故确定图谱记录时间为100m in 。2.4精密度试验取同一批山茱萸药材,按1.2.4方法制备供试液,连续进样5次,测定图谱,结果表明5次进样相对保留时间偏差在0.0020.051之间,5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的R SD 在1.23%1

14、.94%之间,各共有峰相对峰面积及相对保留时间的R SD <3%,表明仪器的精密度良好。2.5重现性试验取同一批山茱萸药材,按1.2.4方法制备供试液样品5份,分别检测指纹图谱,结果表明各共有峰相对保留时间偏差在0.0010.029之间,5%总峰面积的各共有峰相对峰面积的R SD 在0.36%2.81%之间,各共有峰相对峰面积及相对保留时间的R SD <3%,表明方法重现性良好。2.6稳定性试验取同一批山茱萸药材,按1.2.4方法制备样品溶液,分别在0h ,4h ,8h ,12h ,24h 检测指纹图谱,结果表明各共有峰相对保留时间标准偏差分别在0.0040.048之间,5%总峰面

15、积的各共有峰相对峰面积的R SD 在1.11%2.51%之间。各共有峰相对峰面积及相对保留时间的R SD <3%,表明样品溶液在24h 内稳定。4291西北植物学报24卷2.7HPLC 指纹图谱及技术参数2.7.1指纹图谱及各共有峰的标定对不同样品进行测定,记录100m in 色谱图,图3。比较不同样品的色谱图,同时对各色谱峰的紫外光谱图进行比较,色谱图中可察见的峰有20多个,构成指纹特征的峰有17个,将图谱分为4个指纹区,分别为 区,R T 为1025m in ,有5个峰; 区,R T 为4055m in ,有5个峰; 区,R T 为6575m in ,有5个峰; 区,R T 为901

16、00m in ,有2个峰,见图3、4。其中对照品马钱素分布在 区,熊果酸和齐墩果酸分布在 区。多批样品图谱中有10个色谱峰为其共有的,因此确定为共有指纹峰。经与对照品比较,鉴定其中3个峰,分别为马钱素(峰5、齐墩果酸(峰9、熊果酸(峰10,见图24 。图3山茱萸H PL C 指纹图谱F ig .3F ingerp rints of M .of f icinale图4示山茱萸指纹图谱指纹 、 区F ig .4Show the rigi on 、of F ingerp rints of M .of f icinale 2.7.2指纹图谱技术参数根据中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行,以参照物峰

17、(S 的相对保留时间和相对峰面积为1,计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。马钱素为山茱萸中主要有效成分,且其峰面积在图谱中相对较大,保留时间适中,故选择马钱素为参考峰(S 1,以其保留时间和峰面积值为1,计算各样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积。按样品制备方法制备样品溶液,测定23批样品图谱,共有峰相对保留时间和相对峰面积见表3、图4,图5。由表3、4可得出,23批样品中10个共有峰的相对保留时间为:1(0.349±0.003,2(0.419±0.004,3(0.956±0.002,4(0.979±0.001,5(S 1(1,6(1.024

18、7;0.004,7(1.476±0.004,8(1.489±0.003,9(S 2(2.003±0.006,10(S 3529110期王花红,等:山茱萸药材指纹图谱的研究(2.018±0.007,相对峰面积为:1(0.774±0.327,2(5.641±1.444,3(1.259±0.642,4(0.259±0.087,5(S 1(1.000,6(0.742±0.343,7(0.668±0.247,8(1.168±0.566,9(S 2(0.152±0.056,10(S 3(

19、0.409±0.140。根据23批样品的相对保留时间及指纹图谱的 。图5山茱萸样品H PL C 图谱F ig .5T he fingerp rints of M .of f icinale表3山茱萸指纹图谱共有峰相对保留时间结果T able 3R esults of RR T of common peak in fingerp rints of M .of f icinale峰号N o .peak6291西北植物学报24卷10 期 王花红, 等: 山茱萸药材指纹图谱的研究 表 4山茱萸指纹图谱共有峰相对峰面积结果 T ab le 4R esu lts of RA of comm on

20、 p eak in fingerp rin ts of M . of f icina le 1927 峰号 N o. p eak 1 1. 563 0. 619 0. 661 0. 985 0. 861 1. 001 0. 566 0. 539 0. 360 0. 426 0. 959 0. 338 0. 833 1. 020 1. 103 0. 552 1. 787 1. 540 2. 000 1. 438 1. 610 1. 212 0. 844 2 2. 747 6. 581 5. 185 4. 279 6. 242 6. 213 6. 445 5. 037 4. 847 5. 300

21、6. 682 2. 968 5. 860 7. 599 7. 810 6. 466 3. 576 6. 154 8. 782 3. 427 6. 818 3. 484 2. 741 3 0. 772 1. 225 0. 626 0. 508 1. 123 1. 902 1. 265 0. 726 0. 774 1. 402 1. 940 0. 451 2. 043 1. 750 0. 979 2. 656 1. 148 1. 836 6. 376 1. 828 0. 861 1. 502 0. 735 4 0. 246 0. 216 0. 225 0. 214 0. 343 0. 217 0.

22、 260 0. 142 0. 169 0. 186 0. 302 0. 275 0. 239 0. 380 0. 492 0. 235 0. 147 0. 318 0. 266 0. 221 0. 281 0. 250 0. 192 5 ( S1 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 6 0. 430 0. 354

23、 0. 775 0. 357 1. 206 0. 581 1. 474 0. 607 0. 978 0. 664 0. 951 0. 510 0. 440 1. 170 0. 943 0. 433 0. 755 0. 747 0. 492 0. 539 0. 387 0. 340 0. 501 7 0. 361 0. 800 0. 687 0. 401 0. 750 0. 373 0. 835 0. 722 0. 832 0. 737 0. 942 0. 332 0. 431 1. 103 0. 955 0. 424 0. 313 0. 680 1. 900 1. 466 0. 395 0.

24、205 0. 439 8 1. 511 0. 110 1. 132 0. 138 1. 776 1. 168 1. 728 0. 988 1. 006 1. 470 1. 859 0. 615 0. 848 1. 949 1. 493 0. 898 1. 288 1. 790 0. 569 0. 173 0. 800 1. 102 1. 403 9 ( S2 0. 122 0. 129 0. 155 0. 129 0. 205 0. 114 0. 214 0. 115 0. 139 0. 154 0. 153 0. 092 0. 106 0. 198 0. 308 0. 101 0. 115

25、0. 194 0. 177 0. 109 0. 110 0. 089 0. 092 10 ( S3 0. 324 0. 386 0. 454 0. 368 0. 599 0. 282 0. 582 0. 311 0. 388 0. 354 0. 397 0. 243 0. 285 0. 527 0. 751 0. 289 0. 327 0. 510 0. 527 0. 312 0. 283 0. 235 0. 259 样1 样2 样3 样4 样5 样6 样7 样8 样9 样 10 样 11 样 12 样 13 样 14 样 15 样 16 样 17 样 18 样 19 样 20 样 21 样

26、22 样 23 表 5山茱萸指纹图谱相似度计算结果 T ab le 5R esu lts of si ila rity of fingerp rin ts of M . of f icina le m 样品号 Sam p les 1 0. 876 13 0. 984 2 0. 983 14 0. 994 3 0. 991 15 0. 992 4 0. 972 16 0. 967 5 0. 998 17 0. 929 6 0. 992 18 0. 989 7 0. 981 19 0. 849 8 0. 994 20 0. 868 9 0. 983 21 0. 988 10 0. 989 22 0

27、. 950 11 0. 991 23 0. 939 12 0. 975 相似度 Sim ilarity 样品号 Sam p les 相似度 Sim ilarity 平均相似度 A verage of sim ilarity 0. 964 3讨论 3. 1流动相的选择 含五环三萜酸和环烯醚萜甙类等成分的光谱图选择 检测波长。 由于五环三萜类成分多为端吸收类物质, 最大吸收均在 200 nm 左右处, 环烯醚萜甙类成分 最大吸收在 230 nm 左右。试验表明在 230 nm 处图 谱信息量少, 不足以显示指纹特征, 所以为兼顾两类 成分均能有较高检测响应值, 实验选取 210 nm 为 实际检测

28、波长, 得到色谱峰数目适中、 分离度较好的 图谱。 3. 3对照品的选择 实验过程中选择了多种流动相系统: ( 1 甲醇2 水梯度洗脱; ( 2 甲醇20. 4% 磷酸梯度洗脱; ( 3 乙腈 2水梯度洗脱; ( 4 乙腈20. 4% 磷酸梯度洗脱。结果表 乙腈相对较好, 故实验选取 ( 4 号系统为流动相。 3. 2检测波长的选择 明酸性环境有利于各色谱峰的分离, 而甲醇由于在 检测波长处吸收较强, 梯度洗脱时基线漂移严重, 而 马钱素属环烯醚萜甙类物质, 水溶性较强, 为山 茱萸中有效成分, 而且含量较丰富, 在图谱中出峰时 实验采用二极管阵列检测器, 结合山茱萸中所 © 199

29、4-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 1928 西北植物学报 24 卷 间适中, 稳定性、 分离度均较好, 故选为对照品之一; 熊果酸和齐墩果酸也是山茱萸 中 的 主 要 有 效 成 分 9, 10 计算结果表明除样品 1、 、 相似度较低外, 其它 19 20 样品相似度均在 0. 9 以上, 表现出良好的相似性。 而 所收集样品中, 样品 1 为 2001 年产药材, 放置时间 较久, 可能导致药材变质, 因而相似度较低; 样品 19、 为 2002 年产的药材公司收购

30、的药材, 因保存 20 , 且能在图谱中显示, 故也选为对照品。 3. 4提取方法的选择 实验以尽可能多体现山茱萸中主要成分为原 则, 设计样品溶液制备方法。 分别选取氯仿、 乙酸 苯、 乙酯、 正丁醇、 甲醇、 乙醇为提取溶媒, 并对提取物 H PL C 图谱分析, 经比较认为醇提物图谱信息比较 不当已有霉变现象, 相似度也较低, 由此可见, 指纹 图谱相似度评价标准与药材品质有较好的一致性; 而熊果酸含量测定结果表明样 19、 均高于所测样 20 品的平均值, 而样 1 熊果酸含量也较低, 如果只考虑 其中熊果酸含量, 则样 19、 都属于较高质量的药 20 材, 这与药材霉变现象不符。

31、因此, 本研究结果从一 定程度上表明指纹图谱为更全面的药材质量控制手 段。 丰富, 既含脂溶性成分也包括水溶性部分, 符合指纹 图谱整体性的要求, 能较好反应药材指纹特征, 故确 定甲醇作为山茱萸指纹图谱的提取溶媒。 3. 5山茱萸指纹图谱相似度评价 实验分别测定 24 批样品指纹图谱, 相关系数法 致谢: 本文实验中曾得到高锦明教授的指导。 参考文献: 1 国家药典委员会. 中华人民共和国药典 M . 北京: 化学工业出版社, 2000: 22. 2 DA I Y ( 戴岳 , HAN G B Q ( 杭秉茜 , HU AN G C L ( 黄朝林. A n ti2inflamm ato r

32、y effect of aqueou s ex tract of M acroca rp ium of f icina le J . Ch ina J ou rna l of Ch inese M a teria M ed ica ( 中国中药杂志 , 1992, 17 (5 : 307 ( in Ch inese. na l of Ch ina P ha rm aceu tica l U n iversity ( 中国药科大学学报 , 1990, 21 (4 : 226- 228 ( in Ch inese. nese T rad itiona l and H erba l D rug s

33、( 中草药 , 1990, 21 (3 : 17- 20 ( in Ch inese. 3 DA I Y ( 戴岳 , HAN G B Q ( 杭秉茜 , HU AN G C L ( 黄朝林. Effect of M acroca rp ium of f icina le on im m uno reaction of m ou seJ . J ou r2 4 ZHAO W S ( 赵武述 , ZHAN G Y Q ( 张玉琴 , L I H ( 李浩. Stud ies on M acroca rp ium of f icina le and its im m uno log ical activitiesJ . Ch i2 5 ZHAO S P ( 赵世萍 , CH EN Y W ( 陈玉武 , GU O J Z ( 郭景珍. A n t