仪器分析 色谱Ｒ

1、色谱方法概论分类：见P353图重要概念：1. 色谱流出曲线：由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称色谱图2. 对称因子fs：描述色谱峰的对称程度。，小于0.95为前沿峰，大于1.05为拖尾峰。3. 保留时间（tR）:从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔，即从进样到某个组分的色谱峰顶点的时间间隔。基本定性参数，主要用于定距展开4. 死时间（t0）：分配系数为零的组分，即不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。5. 调整保留时间：tR=tR-t06. 保留体积（VR）:保留时间内通过色谱柱的流动相体积。 7. 相对保留值(r)：两组分的调整保留值之比，是色谱系统的选择性指标。8

2、. 保留指数（I）:在GC中，把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为。即以正构烷烃作为组分相对保留值的标准，用两个保留是紧邻待测组分的基准物质来标定组分。9. 半峰宽（W1/2）：峰高一半处的峰宽。W1/2=2.35510. 分离度（R）：相邻两组分色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。 R=1.5（tR±3s）时两峰完全分离11. 分配系数（K）：一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的浓度之比。K=Cs/Cm12. 容量因子（k）：在一定温度和压力下，达到平衡时，组分在固定相和流动相中的质量之比。k=mS/mm=KVs/Vm13. 涡流扩散：在填充色

3、谱柱中，由于填料颗粒直径大小不等，填充不均匀，使同一个组分的分子经过多个不同长度的途径流出色谱柱，使色谱峰展宽。14. 纵向扩散：由于浓度梯度的存在，组分将向区带前、后扩散，造成区带展宽的现象。15. 传质阻抗：组分在溶解、扩散、转移的传质过程中所受到的阻力重要理论：1. 色谱分离的原理：组分在固定相和流动相间进行反复多次的“分配”，由于分配系数的不同而实现分离。2. 塔板理论：描述组分在色谱柱中的分配行为。假定：组分在两相间瞬间达到平衡；流动相间歇式进入；试样和新鲜流动相均加在0号塔板上，纵向扩散可忽略；分配系数为常数。 理论塔板高度：H，H=L/n 理论塔板数：n，n=(tR/) 2=16

4、(tR/W)2 3. 速率理论:解释影响塔板高度或使色谱峰展宽的各种因素,包括涡流扩散,纵向扩散,传质阻抗和流动相线速度. H=A+B/u+Cu基本色谱类型 ，色谱类型基本原理相关公式流动相和固定相洗脱顺序分配色谱法组分在两相之间溶解度的差异导致分配不均而分离K=Cs/CmK为狭义分配系数固定相为涂在载体上的液体流动相:GC为氢气或氮气;液液为不相容液体正相色谱极性弱的先出峰,反相色谱极性强的先出峰吸附色谱法组分对固定相表面吸附中心吸附能力不同而分离固定相：吸附剂,硅胶等流动相：极性强洗脱能力强,多二元混合溶剂Ka大的后洗脱极性强的后洗脱.离子交换色谱法组分离子的交换能力不同而分离，固定相为离

5、子交换剂，常用离子交换树脂和硅胶化学键和离子交换剂；价态高的离子交换能力强，同价态水合半径小的强，离子强度大的流动相强，树脂交联度越大，保留时间越长空间排阻色谱法组分的分子线团尺寸不同而分离固定相为多孔凝胶；流动相为能溶解试样且润湿凝胶的溶剂分子量大（线团大）的分子先洗脱第十八章 平面色谱概念：一种在平面上进行的基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。一、 平面色谱的分类薄层色谱法纸色谱法二、 平面色谱法的参数定性参数一） 比移值（Rf）： Rf = 原点到斑点中心的距离（L）/ 原点到溶剂前沿的距离（L0）1. Rf值的影响因素：受色谱条件影响，误差较大1) 分

6、配系数K，Rf 2) 薄层板一定，对于极性组分： 展开剂极性，Rf （易洗脱） 对于非极性组分： 展开剂极性，Rf （不易洗脱）二） 相对比移值（Rr）：消除系统误差，数值可 < 1，也可 > 1Rr = 原点到样品斑点中心的距离 / 原点到参考物质斑点中心的距离三） 相平衡参数：分配系数和容量因子四） 面效参数：1、 理论塔板数：反映组分在流动相和固定相中动力学特征，代表色谱分离效能的指标。取决于色谱系统的物理特性2、 塔板高度：由理论塔板数及原点到展开剂前沿的距离算出的单位理论塔板长度 H=L0/n五） 分离参数：分离度（resolution）：两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽

7、度的比值。R=2(L1-L2)/(W1+W2)分离数：评价面效。相邻两斑点分离度为1.177时，Rf=0和Rr=1之间容纳的色谱斑点数。SN=L0/(b0+b1)-1薄层色谱法特点：1.分离能力强，斑点集中2 灵敏度高 3 展开时间短 4 预处理简单 5 上样量较大 6 一起简单，操作方便一、 薄层色谱法的主要类型色谱类型分离原理 载 体 固 定 相流 动 相 比 移 值 顺 序吸附薄层色谱 吸附 硅胶 有机溶剂 极性小的比移值大正相薄层色谱 分配 硅 胶 水 有机溶剂 极性小的比移值大反向薄层色谱 分配 硅 胶 硅胶键合相 水-有机溶剂 极性小的比移值小纸色谱 分配 滤 纸 水 水-有机溶剂

8、 极性小的比移值大二、 吸附薄层色谱的吸附剂和展开剂一） 吸附剂：硅胶、氧化铝、聚酰胺1. 硅胶（SiOH）：用前需活化1) 吸附力与含水量有关，含水量，吸附活性2) 呈弱酸性（能与碱性物质作用）3) 分离酸性和中性物质（有机酸、氨基酸、甾体等）；种类：硅胶H（不含粘合剂），硅胶G（含粘合剂，硅胶和煅石膏）、硅胶HF（不含粘合剂，荧光剂）硅胶GF（含煅石膏，荧光剂）2. 氧化铝1) 吸附力也与含水量有关（同硅胶）2) 中性、碱性、酸性3种3) 种类（同硅胶）：氧化铝G、H、HF等二） 展开剂1. 选择原则：相似相溶三、 薄层色谱操作方法一） 薄层板的制备1) 常用的粘合剂：煅石膏、羧甲基纤维素

9、钠玻璃板表面光滑、清洁，硬板（含粘合剂，羟甲基纤维素钠LMC-Na，煅石膏）和软板（不含粘合剂），硅胶-CMC机械强度好，硅胶-G板，机械强度差二） 点样1) 试样溶于适当溶剂（甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等）中，溶剂应尽量避免有水（含水斑点易扩散，难挥发除去）2) 点样线距底边1.5 2cm3) 试样斑点面积越小越好4) 分次点样，点样间距的精确是保证定量精确度的关键三） 展开1) 展开槽和展开板展开前须先用展开剂蒸汽饱和，以消除边缘效应；边缘效应：同一物质在同一薄层板上出现中间的Rf < 边缘的Rf2) 展开方法：上行法硬板、下行法纸色谱、径向展开纸色谱、多次展开硬板（样品浓度较稀）四）

10、显色：1 在日光下观察2 紫外3 荧光检验4 显色剂（常用：碘，硫酸和荧光黄）四、 定性和定量分析一） 定性分析：已知物对照法依据：在固定的色谱条件下，相同物质的Rf值相同。若两物质Rf不同，肯定不是同一物质；若两物质Rf相同，则可能是同一物质二） 定量分析：洗脱法，直接定量法（目视比较法和薄层扫描）五、 薄层扫描：双波长，测定波长（最大吸收）和参比波长（空白）；反射法：线性扫描（荧光测定必须）和曲线扫描（形状不规则，浓度分布不均），用外标法、内标法和归一化法定量第三节纸色普法（与薄层色谱相似）一、 纸色谱法的分离原理1. 纸色谱法：以纸为载体的色谱法，属于属于正相分配色谱（流动相极性固定相极

11、性）二、 实验条件1. 色谱滤纸的选择质地均匀、平整无折痕，有一定机械强度；松紧适宜；纸质纯，无明显的荧光斑点2. 固定相：纸纤维上吸附的水分或其他物质3. 展开剂：水饱和的正丁醇、正戊醇等含水有机溶剂第十九章 气相色谱法特点：1、高分辨效能2、高选择性3、高灵敏度4、分析速度快5、应用范围广6、样品应易于气化 气液固定相：固定液和载体： 固定液：、 要求：操作温度下蒸气压低（最高使用温度）；稳定性好，不与载体发生反应；对组分选择性高；对各组分有充分的溶解能力、 选择：相似相容性，样品固定液作用力出柱顺序非（弱）极性非极性色散力低沸点先出柱，相同沸点极性先出中等极性中等极性诱导力和色散力低沸点

12、先出柱，沸点相同极性后出极性（强）极性极性静电力极性强后出柱形成氢键的试样氢键型氢键力不易形成氢键的化合物先出柱 载体：、 要求：表面积大，孔径分布均匀；表面没有吸附性能；热稳定性好，化学稳定性好；粒度均匀，有一定机械强度、 硅藻土型载体：常用，分红色载体（氧化铁，与非极性配伍）和白色载体（助熔剂，与极性配伍）、 载体钝化：去除表面硅醇基及金属氧化物。有酸洗法（去除铁等氧化物，分析酸性物质），碱洗法（去除氧化铝等，分析碱性物质）和硅烷化法（硅醇基，分析形成氢键较强的）气固色谱固定相：常用吸附剂、分子筛、高分子多孔微球、化学键合相（较好）流动相：载气，常用氢气（热导检测器常用）和氮气（除热导检测

13、器外常用）检测器：将各组分浓度或质量变成电信号 性能指标：灵敏度（浓度型检测器用SC,mV ml/mg,质量型用Sm, mV s/g）,噪音和漂移（无样品通过时基线的起伏为噪音，基线单位时间内单方向变化的幅值为漂移）检测限（峰高为噪音峰高两倍时，单位时间内在其引入检测器中该组分的质量。D=2N/S1,越小越好）、 氢焰离子化检测器（FID）：有机物在氢焰作用下，化学电离形成电子流进行检测。灵敏度高，噪音小，死体积小。最常用。缺点为破坏性检测，只能检测含碳物质。须注意气体及流量（N2:H2:Air=1:1-1.5:10）,质量型，峰高定量，载气流速恒定。峰面积定量可以的，实际中常用峰面积定量的。

14、、 热导检测器（TCD）：组分与载气的热导率差别来检测。氮气灵敏度低，加电流前须通载气，增加电流提高灵敏度，浓度型，峰面积定量，载气流速恒定、 电子捕获检测器（ECD）:高选择电负性强的元素，灵敏度高，用氮气或氩气作载气分离条件选择： 速率理论：H=A+B/u+Cu 涡流扩散A：与填充物平均直径和填充不规则因子正比。用粒度较细、颗粒均匀的载体，尽量填充均匀降低A 分子扩散项B/u：与分子扩散系数正比，与载气平均线速度反比。用分子量较大的载气、控制较低柱温、较高的载气流速降低B/u，载气低速用氮气，高温用氢或氦气 传质阻抗项Cu：气相阻抗和液相阻抗，降低固定液薄膜厚度，增大组分在液相中的扩散系数

15、。总结：提高柱效 填充物 粒度 6080目/80100目 均匀 载气 种类分子量大 流速略大于最佳流速 固定液 类型粘度小 数量少 35% 柱温 统筹考虑，一般选低温柱。 实验条件选择：、 提高和k:决定于试样中各组分本身性质,固定相(可选)和流动相、 提高n,:载气流速和种类(低速氮气,高速氢气,线速度稍高于最佳流速);柱温(高沸用低固定液配比高灵敏度检测器,宽沸点用程序升温),柱长和内径选择;其他条件(气化室温度,检测室温度,进样时间和进样量)样品预处理:分解法和衍生化法毛细管气相色谱法特点:分离效能高;柱渗透性好;柱容量小;实现气-质联用;应用范围广实验条件:毛细管直径(越小柱效越高,多

16、采用细内径短毛细管);载气选择(依据:分离效能和分析速度;检测器适应性和灵敏度;物理化学性质)和液膜厚度(薄膜)色谱系统: 毛细管柱制备:拉制,柱表面处理,固定液的涂渍等,常用玻璃和石英.表面需粗糙化(化学反应法和沉积细颗粒法) 动态或静态法涂渍固定液 进样系统:分流进样(需分流进样器)气相色谱定性和定量分析 定性:与光谱法相比,可以分离多种试样,但无法对未知物定性.常用方法:已知物对照法;利用相对保留值;利用保留指数;官能团分类测定;气-质,气-红外联用 定量: 定量校正因子,氢焰检测器常用正庚烷作标准 定量方法: 归一化法: 外标法:峰面积对对照品量作校正曲线.外标一点法定量内标法:,内标

17、物选择(试样中不存在的纯物质;加入量接近被测组分;色谱峰位于被测组分色谱峰附近并与其完全分离)内标校正曲线；内标对比法；定量方法在和中是一致的二十章 高效液相色谱法特点:1. 与经典液相色谱相比,优点:应用颗粒极细、规则均匀的固定相，传质阻抗小，柱效高，分离效率高；分析速度快；高灵敏度检测器；2. 与GC相比，优点：不受试样的挥发性和热稳定性限制，应用范围广；可选不同性质溶剂作流动相，分离选择性高；室温条件进行，不需高温。类型：按分离机制：分配、吸附、离子交换和空间排阻。在HPLC中常见的：化学键合相色谱法、离子抑制色谱法（ISC）和离子对色谱法(PIC) （均属于分配色谱范畴）化学键合相色谱

18、法： 正相键合相色谱法：采用极性键合相为固定相，非极性和弱极性溶剂加适量极性调节剂为流动相。主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。极性强的组分后洗脱，流动相极性强洗脱能力强。 反相键合相色谱法：采用非极性键合相为固定相，极性调节剂+水作流动相；常用甲醇-水和乙腈-水。一般认为是固定相的非极性基团和极性溶剂中的非极性组分发生疏溶剂缔合。主要受溶质分子结构（极性越弱疏水性越强k越大）和流动相（极性小k大，抑制溶质离解k增大，离子抑制色谱法）以及固定相（键合烷基的疏水性随碳链增长而加强，k大） 反相离子对色谱法：加入离子对，溶质的分配系数决定于离子对的浓度和萃取常数（与固定相、离子

19、对试剂和溶质性质和温度有关）分析酸或带负电荷物质常用季铵盐离子对（四丁基季铵盐）；分析碱或带正电荷物质常用烷基磺酸盐或硫酸盐。离子抑制色谱法：加入少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相pH,抑制有机弱酸、弱碱离解，增强其与固定相作用而分离。pH在2-8之间，小结：色谱类型(Mode)固定相(Stationary Phase)流动相(Mobile Phase)主要适用范围(Compound Separated)正相色谱(Normal-Phase)硅胶，氨基、氰基、二醇基键合硅胶烷烃/极性调节剂 在水中不溶解的物质或同分异构体反相色谱(Reversed-Phase)C18、氨基、氰基键合硅胶水/有机

20、溶剂中性、弱酸性、弱碱性物质离子抑制色谱(Ion Suppression)C18、C8键合硅胶水/有机溶剂弱酸、弱碱缓冲盐弱酸、弱碱、两性化合物离子对色谱(Ion-Pair)C18、C8键合硅胶水/有机溶剂离子对试剂有机酸、碱、盐及两性化合物其他色谱： 离子色谱法：离子交换色谱和电导监测器结合分析离子的方法。分抑制型（双柱）和非抑制型（单柱）高效液相色谱法固定相和流动相选择 固定相：颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，耐高压；化学稳定性好，不与流动相反应。 键合相：使用过程中不流失；化学性质稳定；适于梯度洗脱；载样量大 非极性：十八烷基硅烷键合相（ODS或C18）常用于反相色谱 弱极性：醚基和二羟基键合相，正相反相均可，视流动相决定极性：氨基、氰基键合相，一般用于正相