大鼠胃窦部胃泌素和生长抑素mRNA及其相关蛋白表达的研究

1、    大鼠胃窦部胃泌素和生长抑素mRNA及其相关蛋白表达的研究周凡葛振华王若愚 (福建省中医药研究院病理研究所，福州350003) 摘要为探讨大鼠胃窦部胃泌素mRNA和生长抑素mRNA在G、D细胞的转录及其相关蛋白的表达，用免疫细胞化学和原位杂交技术，检测了大鼠胃窦部G细胞内的胃泌素和D细胞内的生长抑素以及它们相应的mRNA。结果显示，大鼠胃窦部的G、D细胞位于幽门腺基部，细胞分布不均，单个或多个在一起；胃泌素和生长抑素均匀地分布于胞质内，核内阴性；G/D细胞比值在1.3±0.321.55±0.75之间，即G细胞多于D细胞。mRNA

2、信号染色强度细胞间有差异，呈极性分布，多位于核周或核上胞质内。mRNA阳性细胞数在单位面积内少于G、D免疫组织化学显示阳性细胞数，原因可能是由于多聚甲醛的固定对mRNA的降解，降低了mRNA的活性，从而导致某些G、D细胞内mRNA不能被检出。该法具有安全、省时、定位准确等优点，适合一般实验室和临床诊断需要。 关键词胃窦G细胞D细胞胃泌素mRNA生长抑素mRNA 原位杂交大鼠 人与动物的胃窦部粘膜和腺上皮中，散在分布着较多的G、D细胞。G细胞分泌胃泌素，可刺激壁细胞分泌胃酸和胃粘膜的生长1；而D细胞则分泌生长抑素，以旁分泌方式调节G细胞胃泌素的分泌2；G、D细胞在调节胃酸的分泌方面起着重要作用。

3、本研究用原位杂交和免疫细胞化学技术，初步探讨了在正常情况下，大鼠胃窦部胃泌素mRNA和生长抑素mRNA在G、D细胞的转录及其相关蛋白的表达。 材料和方法 1.标本制备 5只成年雄性Wistar大白鼠，体重180200g，CO2窒息后，迅速取胃幽门部，用Lillie固定液固定，酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，(厚5m)，用0.1%polylysine粘片，在60温箱烘烤2h，室温保存。 2.免疫细胞化学染色 切片脱蜡入水后，入0.2mol/L HCl 20min(阻断内源性碱性磷酸酶)，水洗5min,pH7.4的PBS(内含0.1% TritonX-100)20 min；加10%正常羊血清

4、室温培育20min(减少背景非特异性染色)，除去多余液体后加兔抗人胃泌素抗体或兔抗人生长抑素抗体(-迈新公司试剂盒)，置湿盒内4冰箱过夜；次日取出湿盒，室温放置45min，PBS洗3次，每次5min；加生物素标记的羊抗兔IgG(1100)室温孵育90min；PBS洗3次，每次5min，加碱性磷酸酶标记的链亲合素(美国Zymed盒试剂)，室温20min；PBS洗1次5min，pH8.4 THB15min，用BCIP-NBT(Zymed盒试剂)暗处显色10 min，入5mmol/L EDTA终止反应，流水洗5min，甘油明胶封片。对照片用PBS代替第一抗体，其他步骤与实验片相同。 3.原位杂交 3

5、.1切片脱蜡入水后，用0.2mol/L HCl配制的0.03%胃蛋白酶室温消化20min，DEPC水洗5min，固定于4%多聚甲醛5min，DEPC水洗2次，每次2min。 3.2入预杂交缓冲液60min，按我室过去的方法配制3；除去多余液体后加入杂交液，置潮湿容器内50温箱过夜。杂交液配制：预杂交缓冲液加入生物素标记的大鼠胃泌素或生长抑素探针,浓度为2g/L(丹麦Larsson教授赠送),探针序列分别为Rat Gas5"-CTGGGGGTGGCTGGAGATG -GCTGGGCT-3"与大鼠胃泌素mRNA互补，Rat Som 5"-TGAGTTAGCAGATCT

6、CTGCAGCT-3"与大鼠生长抑素mRNA互补。次日，取出切片用37预热的0.1×SSC洗4次，每次15min。 3.3检测杂交显色：pH7.4的TBS洗2次，每次5min，加鼠抗生物素的抗体(1100，DaKo)室温60 min；TBS洗3次，每次5min，加生物素标记的兔抗鼠IgG(1250,DaKo)室温45min；TBS洗后加碱性磷酸酶标记的链亲合素(1100，DaKo)室温30 min；pH8.4的预检测缓冲液15min，用BCIP-NBT显色15min，入5m mol/L EDTA 5min终止反应，流水洗5 min，甘油明胶封片。对照片不加探针，其他步骤与实

7、验片相同。全部过程均须带手套，以免污染。 4.观察 在高倍镜(×40)下，每只动物免疫细胞化学染色切片和原位杂交切片，从十二指肠端向胃底腺方向计数10个网格内的阳性细胞，每个网格面积为0.1662mm2，然后求出每只动物单位面积内阳性细胞的平均值和标准差。 结果 G、D细胞及其相应的mRNA染色阳性反应均呈蓝黑色，对照片为阴性。G、D细胞位于幽门腺的下1/3，相当于幽门腺的底部(图1，2)，细胞分布不均，多单个或3个在一起，胃泌素和生长抑素，分布在胞质内，胞核阴性。G细胞多集中在胃窦部，十二指肠腺或上皮内也有少数G细胞，但胃底腺无G细胞；G细胞多呈锥体或卵圆形，基底部膨大而顶部狭窄，

8、开口于腺腔(图1)，这些细胞大都属开放型，很少看到闭合型。D细胞比G细胞稍小，细胞形状各异，有时可见有细胞突起，穿过细胞间隙而达腺体基膜或基膜外(图2a)；D细胞大多属闭合型，也有的细胞一端伸向管腔，形成开放型(图2)。G、D细胞在单位面积内的数目见表1。从表中可看出G、D细胞在单位面积内的数目有差异，但G细胞多于D细胞。 胃泌素mRNA和生长抑素mRNA在细胞内的分布与胃泌素和生长抑素免疫反应性细胞相同(图3，4)，但胃泌素和生长抑素mRNA多聚集在核周边胞质内(图3，4)或核上区胞质内，染色强度细胞间有差异。在单位面积内胃泌素和生长抑素mRNA信号阳性细胞与相应免疫反应性细胞比较，其数值低

9、于G、D细胞，见表2。 表1G、D细胞数目及比值 Table 1 The ratio of G and D cells G细胞 G cells(x±s) D细胞 D cells(x±s) G/D比值 G/D(x±s) 8.6±3.20 6.6±2.60 1.30±0.32 7.8±1.78 5.6±1.80 1.39±0.52 6.8±1.30 5.2±2.38 1.30±0.36 6.2±0.83 4.0±2.34 1.55±0.75 5.6&

10、#177;2.10 3.8±1.30 1.47±0.45 表2G、D细胞数目及相关mRNA的比较 Table 2 Comparision of the number in G,D cells and their mRNA G细胞 G cells (x±s) 胃泌累mRNA gastrin mRNA (x±s) D细胞 D cells (x±s) 生长抑素mRNA somatostatin mRNA (x±s) 8.6±3.20 5.5±1.29 6.6±2.60 4.8±1.92 7.8

11、7;1.78 5.2±2.16 5.6±1.80 4.0±0.70 6.8±1.30 4.8±2.59 5.2±2.38 3.8±0.67 6.2±0.83 4.0±1.58 4.0±2.34 3.4±0.74 5.6±2.10 4.0±1.60 3.8±1.30 2.8±0.80 讨论 免疫细胞化学染色的结果显示，大鼠胃窦部的G细胞，大多属开放型，细胞狭窄一端伸入腺腔，便于接受胃内容物的化学刺激。电镜证实开放型细胞游离端有微绒毛，表明它们可能像

12、味觉细胞一样具有化学感受器功能，调节胃酸的分泌4。D细胞多为闭合型，细胞具有较长的突起，突起末端不达腺腔，而是穿越几个细胞间隙达到基膜或基膜外；也有部分细胞属开放型，一端伸入腺腔，Lamberts等5认为此类细胞约占30%。关于G、D细胞内分泌释放的方式目前还有争论，我们认为G细胞是以内分泌的方式，将胃泌素先释放入局部的微血管，然后经过血液循环对胃底腺壁细胞的分泌产生生物效应，因胃底腺缺乏G细胞，所以不可能以旁分泌方式影响壁细胞盐酸的分泌，而胃窦部的D细胞则可以旁分泌方式调节G细胞的分泌。生长抑素在调节胃酸分泌方面起着重要的作用。在胃底腺的D细胞可直接抑制壁细胞的分泌，在胃窦部的D细胞是通过抑

13、制胃窦的G细胞活动间接减少胃酸的分泌5。G、D细胞的突起由于切片厚度和切面方向等因素，在切片上很难观察到突起的全貌。Larsson6用免疫荧光双染法观察到，大鼠胃窦部的G、D细胞紧密相邻，相互接触或拥抱，可见两者关系密切。G/D细胞的比值，虽然个体间有所差异(表1)，但其比值大于1则是一致的。 用Lillie固定液固定的标本，能够较好地保存胃泌素和生长抑素的免疫反应性。生物素标记的胃泌素和生长抑素寡核苷酸探针，能较容易透入细胞质，经过抗体-链亲合素-碱性磷酸酶(ASAP)过程后，用BCIP-NBT显色，准确地将mRNA定位在G、D细胞内。它们多分布在核周以及核上的胞质内，但mRNA由核内转运到

14、细胞质并分布在特定位置的机理还不清楚。G、D细胞mRNA信号染色强度不同，反映了细胞间mRNA含量的差异，这可能与细胞生理活动有关。Larsson等2认为在幽门腺最底部衰老的G、D细胞几乎检测不到相应的mRNA，与D细胞密切接触的G细胞mRNA也显著减少。实验结果不仅提示了G、D细胞功能上的关系，也反映了细胞内mRNA转录或表达伴随着细胞的生理活动有所变化。G、D细胞在单位面积内数目高于相关mRNA信号阳性数目(表2)的原因可能是由于固定液中的多聚甲醛对mRNA的降解，降低了mRNA的活性，从而导致mRNA阳性细胞减少。Larsson7用免疫荧光双染法也证明绝大多数G、D细胞可同时表达mRNA

15、及其相关蛋白，也有少数细胞仅含mRNA或相关蛋白成分。 我们在实践中体会到用非放射性标记、人工合成的胃泌素和生长抑素寡核苷酸探针，进行原位杂交检测靶细胞内特异性mRNA，有很大的实用价值，不仅检测系统安全，而且定位准确，节省时间，适合一般实验室和临床诊断的需要。 本文照片由龚远芳同志帮助洗印，特此致谢。 收稿 1997-05修回 1997-09 图版说明 图1大鼠胃窦部粘膜G细胞()一端伸入腺腔(L)×600(下同) 图2大鼠胃窦部粘膜，少数D细胞()一端伸入腺腔(L)，多数细胞位于腺细胞底部()，有的D细胞突起穿过细胞间隙到达基膜处(2a内) 图3示胃泌素mRNA信号,有的mRNA

16、位于核周围()，有的位于核上区的胞质内() 图4示生长抑素mRNA信号，有的mRNA位于核周围的胞质内()，有的位于核上区的胞质内() Explanation of figures Fig.1 Showing the G cells()in the rat antrum,the narrow end of cells extended to the lumen of glands(L).×600 (The same as follows) Fig.2 A few D cells() were seen in the antral mucosa,one end of cells ext

17、ended to the lumen of glands(L),but most of D cells located in the basal part of glandular cells().One process of D cell passed through intercelluar space and end at the basement membrane(Fig.2a). Fig.3 Showing gastrin mRNA signal apppeared in the cytoplasm()or the supernuclear cytoplasma(). Fig.4 S

18、howing somatostatin mRNA signal distributed in the cytoplasm()or the supernuclear cytoplasma(). 参考文献 1Larsson L-I,Hougaard DM.Combined non-radioactive detection of peptide hormone and their mRNA"s in endocrine cells.Histochemistry,1991,96(5):375 2Larsson L-I,Hougard DM.Evidence for paracrine so

19、matostatinergic regulation of gastrin gene expression by double staining cytochemistry and quantitation.J Histochem Cytochem,1994,42(1):37 3葛振华，王长青，王若愚.用生物素标记的寡核苷酸探针检测人淋巴细胞组织和淋巴瘤内免疫球蛋白轻链mRNA.中国组织化学与细胞化学杂志，1993，2(4)：276 4成令忠主编.组织学.北京：人民卫生出版社，1993：11261127 5Lamberts R,Stumnps D,Plumpe L,et al.Somatost

20、atin cells in rat antral mucosa:quantitative ultrastructural analysis in different states of gastric acid secretion.Histochemistry,1991,95(4):373 6Larsson L-I,Goltermann N,Schwartz TW,et al.Somatostatin cell processes as pathway for paracrine secretion.Science,1979,205(9):1393 7Larsson L-I,Hougaard

21、DM.Non-radioactive in situ mRNA hybridization using synthetic oligonucleotides:Principles,combination with immmunocytochemistry and quantitation.Neuroscie Protoc,1993,20(1):1 EXPRESSION OF GASTRIN,SOMATOSTATIN AND THEIR CORRESPONDING mRNA IN RAT ANTRUM Zhou Fan,Ge Zhenhua,Wang Ruoyu (Department of P

22、athology, Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy,Fuzhou) In situ hybridization and immunocytochemical technique have been used to detect the gastrin,somatostatin and their corresponding mRNA in G,D cells of rat gastric antrum.The results showed that G,D cells one or three cells together located in basal part of pyloric glands,Gastrin and somatostatin distributed homogenously in cytoplasma,but the nuclei were negative.The number of G cells was more than that of D cells,and their ratio was ranged from 1.3±0.32 to 1.55±0.75.The staining intensity of mRNA signa