分光光度法测定水体叶绿素a含量的测量不确定度分析

1、仲恺农业技术学院学报,16(3 :2532,2003Journal o f Zhongkai Agrotechnical College文章编号:1006-0774(2003 03-0025-08分光光度法测定水体叶绿素a 含量的测量不确定度分析余文永, 胡迪琴, 年冀, 黎映雯, 朱大明(广州市环境监测中心站, 广东广州510030摘要:采用分光光度法测定湖泊、水库水体中叶绿素a , . 类数量的多寡, 按1L 和0. 1L 2个采样量采样. 析取样量、样品前处理、仪器吸光度读数、. 律建立数学模式, , (u c 和扩展不确定度(U . 1L ,U 0. 214mg/m 3和2. 32mg

2、/m 3.; 水体; 测量不确定度:X173文献标识码:A一切测量都不可避免地存在不确定度. 20多年来, 国外在测量不确定度的评定方面做了大量的工作, 国际标准化组织(IS O 于1993年发布了测量不确定度的评定标准1. 为了适应全球经济一体化发展的需求,20世纪90年代末, 我国在检测和校准领域亦引用不确定度概念, 取代传统的误差评定, 并颁布了相应的评定标准2,3. 中国实验室国家认可委员会按IS O/IEC 17025校准和检测实验室能力的通用要求对校准和检测实验室认可时, 亦有测量不确定度的评定要求4.某一检测项目的测量不确定度是实验室经过评定给出, 测量不确定度在某种程度上能反映

3、实验室的分析水平. 目前, 水体叶绿素a 含量的测量不确定度分析尚未见有报道. 作者通过分析水体叶绿素a 含量的测量不确定度, 找出影响测量不确定度的因素, 给出不确定度, 如实反映测量的置信度和准确性.1测量方法按浮游植物采样方法57采样, 水库水样品量为1L , 湖泊、池塘水为011L. 用玻璃纤维滤膜浓缩水样, 并将滤膜样品置于4以下冰箱68h , 用体积分数90%的丙酮研磨提取叶绿素a , 加入少量碳酸镁粉防止酸化, 然后30004000r/min 离心10min , 取上清液, 再提取1次, 用体积分数90%的丙酮定容至10ml. 取上清液以体积分数90%的丙酮作参比, 在722收稿

4、日期:2003-02-23作者简介:余文永(1972- , 男, 广东饶平人, 助理工程师.26仲恺农业技术学院学报第16卷型光栅分光光度计上分别读取750、663、645、630nm 波长处的吸光度, 根据下列公式(1 计算叶绿素a 含量. C =( ( ( V 2V 2为样品体积(L ; D 为吸光度; V 1为定容体积(ml ;(1式中:C 为叶绿素a 含量(mg/m 3 ;为比色皿光程(cm .2建立数学模型由公式(1 可见, 被测样品叶绿素a , 4、定比体积(比色管 、( . 由不确定度的传播规律得a C c ( 的方差, 见公式(2 .22222u (D 750 +u (D 66

5、3 +u (D 645 +9D 9D 9D 22222(22( ( ( (2 u D 630+9V 1u V 1+9V 2u V 2+9u式中:u c (C 为样品中叶绿素a 含量测定的合成不确定度;C 9D 2u (D 750 为750nm 波长吸光度的标准不确定度; u (D 663 为663nm 波长吸光度的标准不确定度; u (D 645 为645nm 波长吸光度的标准不确定度; u (D 630 为630nm 波长吸光度的标准不确定度; u (V 2 为样品体积的标准不确定度; u (V 1 为样品定容体积的标准不确定度; 为比色皿光程的标准不确定度. u (公式(2 中各影响因子的

6、传播系数为:C (D 750 =C (D 663 =C (D 645 =-9D 750V 2 =9D 663V 2=-9D 645V 2. V =9D 630V 2(3 (4 (5 (6 (7C (D 630 =C (V 1 =9V 1V 2第3期余文永, 等:分光光度法测定水体叶绿素a 含量的测量不确定度分析27( ( ( (=C (82=9-V 2C (V 2 =( ( ( =9V 2-V 22(93测量不确定度评定311标准不确定度分量评定311114个波长吸光度的标准不确定度分别采集水库水(样品量为1L 和湖泊水(样品量为011L 进行4个波长吸光度的重复性试验, 此部分不确定度包含研

7、磨、离心等前处理过程的影响.4个波长吸光度的标准不确定度(u (DW :(A 类评定, u A 和分光光度计刻度的不确定度(B B :u (A +22(10311111144A 类评定(u A (s x . 样品量为1L 和011L 时,5个平行样品4个波长吸1.表14个波长吸光度均值( x 及其标准偏差(s ( x (n =5T able 1Abs orbency ( x and standard variation (s ( x of four wavelengths样品量1L Volume of sam ple :1L750nm663nm 0. 0166645nm 0. 0054630n

8、m 0. 0046750nm 0. 0022663nm 0. 028645nm 0. 0094630nm 0. 0068吸光度均值 xAbs orbency s ( x 0. 0030. 0005. 1010-44. 0010-44. 0010-42. 0010-46. 3210-42. 4510-42. 0010-43. 1. 1. 24个波长吸光度的不确定度B 类评定722型分光光度计最小刻度的变化为0. 001, 则u B =5. 7710-43. 1. 1. 34个波长吸光度的标准不确定度按公式(10 分别计算出样品量为1L 和0. 1L时,4个波长吸光度的标准不确定度(u (D W

9、(表2 .表24个波长吸光度的标准不确定度(u (D W T able 2S tandard uncertainty of repeated reading of abs orbency in four wavelengths样品量1L V olume of sam ple :1Lu (D 750 u (D 663 u (D 645 u (D 630样品量0. 1L V olume of sam ple :0. 1Lu (D 750 u (D 663 u (D 645 u (D 6305. 7710-47. 7010-47. 0210-47. 0210-46. 1110-48. 5610-46

10、. 2710- 46. 1110-428仲恺农业技术学院学报第16卷3. 1. 2比色皿光程的标准不确定度(B 类 国家计量检定规范178-96规定, 比色皿光程对比最大允差为0. 5%, 属B 类评定, 则=u (=2. 8910-3(cm 3. 1. 3定比体积(10ml 比色管 的标准不确定度定比体积的标准不确定度主要来源于玻璃量具的最大允差、温度变化引起的体积改变及量具刻度读数重复性的标准不确定度分量. 3. 1. 3. 110ml 比色管允差引起的标准不确定度按A 级标准容器要求,10ml 比色管允差为0. 1ml , 自由度V =, 属B 类评定, 则u (V 1-1 =5. 77

11、10-2(ml 3. 1. 3. 2温度变化引起比色管体积变化的标准不确定度3数在20时, =2. 110-4/, 则u (V 1-2 =10-4. 3-3Vt =2. 13. 1. 3. 3, 加蒸馏水至定比刻度, 再称重, , 5次, 换算体积的标准偏差就是定比刻(u (V 1-3 (表3 .表3比色管定比刻度读数重复性试验T able 3Repeatability test in reading colorimetric tube scale1#称重Weight/g (22. 530. 261010. 044110. 078120. 18352#30. 231410. 014510. 0

12、47920. 18353#30. 19049. 973510. 006920. 18354#30. 233410. 016510. 049920. 18355#10. 005510. 038920. 1835u (V 1-3 /ml30. 22241. 5910-3水的质量Mass of water/g水的体积V olume of water/ml (20管干重Net weight of tube/g3. 1. 3. 4定比体积的标准不确定度定比体积(10ml 比色管 的标准不确定度为:u (V 1 =(V 1-1 2+(V 1-2 2+(V 1-3 2(5. 7710-2 2+(6. 310

13、-3 2+(1. 5910-3 2=5. 8110-2(ml 3. 1. 4样品体积(容量瓶 的标准不确定度样品体积的标准不确定度来源与定容体积相同.3. 1. 4. 11L 容量瓶的标准不确定度(1 1L 容量瓶允差引起的标准不确定度:1L 容量瓶(A 级 最大允差为0. 40ml , 自由度V =, 属B 类评定, 则u (V 2-1 =0. 23(ml (2 温度变化引起容量瓶体积变化的标准不确定度 :设温度变化3, 水的膨胀系数在20时, =2. 110-4/, 则第3期余文永, 等:分光光度法测定水体叶绿素a 含量的测量不确定度分析29u (V 2-2 =10Vt =2. 1-431

14、000. 0=0. 63(ml (3 1L 容量瓶的标准不确定度:1L 容量瓶刻度线读数重复性的不确定度较小, 可忽略不计, 则1L 容量瓶的标准不确定度为:u (V 2 =u (V 2-1 +u (V 2-2 =0. 67(ml 223. 1. 4. 20. 1L 容量瓶的标准不确定度(1 0. 1L 容量瓶允差引起的标准不确定度:0.1L 容量瓶(A 级 最大允差为0. 10ml , 自由度V =, 属B 类评定, 则u (V 2-1 =5. 7710-2(ml (2 温度变化引起容量瓶体积变化的标准不确定度评定:设温度变化3系数在20时, =2. 110-4/, 则Vt =2. 1u (

15、V 2-2 =10-43100. =-2(3 , 换算(2-3 (表4 .4容量瓶定容刻度读数重复性试验T able 4Repeated test in the reading of container bottle scale1#称重Weight/g (22. 5157. 648499. 6778100. 011857. 97062#157. 603699. 633099. 967057. 97063#157. 633199. 662599. 996557. 97064#157. 632399. 661799. 995757. 97065#99. 662199. 996157. 9706u

16、(V 2-3 ml157. 63277. 2710-3水的质量Mass of water/g水的体积V olume of water/ml (20瓶干重Net weight of bottle/g(4 0. 1L 容量瓶的标准不确定度为:u (V 2 =(V 2-1 2+(V 2-2 2+(V 2-3 2(5. 7710-3 2+(6. 310-2 2+(7. 2710-3 2=3. 2计算合成标准不确定度=6. 3710-2(ml 样品量为1L 和0. 1L 时, 标准不确定度分析结果分别见表5、表6. 将各波长吸光度均值代入公式(7 (9 , 按公式(3 (9 , 计算出样品量为1L 和0

17、. 1L 时, 各影响因子的传播系数, 再将各影响因子的传播系数和标准不确定度分量代入公式(2 , 计算合成不确定度, 结果见表7.3. 3计算扩展不确定度U样品量为1L 的扩展不确定度, 取k =2, 则3U 1=k u c (C 1 =0. 214(mg/m 样品量为0. 1L 的扩展不确定度, 取k =2, 则3U 2=k u c (C 2 =2. 32(mg/m 30 仲恺农业技术学院学报 表5 样品量为 1 L 时的标准不确定度分析 Table 5 The evaluation of standard uncertainty ( volume of sample :1 L 第 16

18、卷 标准不确 定度分量 K inds of standard uncertainty u ( D750 u ( D663 u ( D645 u ( D630 u ( V2 u ( V1 不确定度来源 Sources of uncertainty 750nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 750nm 663nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 663nm 645nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorben

19、cy at 645nm 630nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 630nm 分布特征 Character of distribution 正态 Normal distribution 均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution 均匀 Mean distribution 均匀 Mean distribution 均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution 类型 Type of evaluation A类 Type A B类 Type B

20、 A类 Type A B类 Type B B类 Type B B类 Type B A类 Type A B类 Type B 标准不 确定度 Standard uncertainty 5. 77 - 4 10 7. 70 - 4 10 7. 02 - 4 10 7. 02 - 4 10 6. 7 - 4 (L 10 5. 81 - 2 ( ml 10 样品体积的标准不确定度 Standard uncertainty of sampling scale volume 样品定比体积的标准不确定度 Standard uncertainty of sampling scale volume u ( 比色皿

21、光程的标准不确定度 Standard uncertainty of colorimetric utensil thickness 均匀 Mean distribution 2. 89 - 3 ( cm 10 表6 样品量为 0. 1 L 时的标准不确定度分析 Table 6 The evaluation of standard uncertainty ( volume of sample :0. 1 L 标准不确 定度分量 K inds of standard uncertainty u ( D750 u ( D663 u ( D645 u ( D630 u ( V2 不确定度来源 Sourc

22、es of uncertainty 分布特征 Character of distribution 正态 Normal distribution 均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution 均匀 Mean distribution 均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution 类型 Type of evaluation A类 Type A B类 Type B A类 Type A B类 Type B B类 Type B A类 Type A B类 Type B A类 Type A B类 Type B 标准不 确定度

23、 Standard uncertainty 6. 11 - 4 10 8. 56 - 4 10 6. 27 - 4 10 6. 11 - 4 10 6. 37 - 5 (L 10 750nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 750nm 663nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 663nm 645nm 波长吸光度的标准不确定度 Standard uncertainty of absorbency at 645nm 630nm 波长吸光度的标准不确定度 St

24、andard uncertainty of absorbency at 630nm 样品体积的标准不确定度 Standard uncertainty of sampling scale volume u ( V1 样品定比体积的标准不确定度 Standard uncertainty of sampling scale volume 均匀 Mean distribution 正态 Normal distribution 5. 81 - 2 ( ml 10 u ( 比色皿光程的标准不确定度 均匀 Standard uncertainty of colorimetric utensil thickn

25、ess Mean distribution 2. 89 - 3 ( cm 10 第3期 余文永 , 等 : 分光光度法测定水体叶绿素 a 含量的测量不确定度分析 表7 样品量为 1 L 和 0. 1 L 时各影响因子的传播系数和合成标准不确定度计算结果 Table 7 Dissemination coefficient of influence factors and combined standard uncertainty ( volume of sample : 1 L and 0. 1 L 31 样品量 1 L volume of sample 1 L 各影响因子传播系数 Dissem

26、ination coefficient of influence factors C1 ( D750 C1 ( D663 C1 ( D645 C1 ( D630 C1 ( V1 C1 ( V2 C1 ( 样品量 0. 1 L volume of sample 0. 1 L C2 ( D750 C2 ( D663 C2 ( D645 C2 ( D630 C2 ( V 1 C2 ( V 2 C2 ( uc ( C2 - 95. 8 116. 4 - 21. 6 1. 0 0. 153 - 1. 53 - 1 . 53 0. 107 ( mg/ m3 - 9. 58 2 10 1. 164 3 10

27、 - 2. 16 2 10 10 2. 85 - 2. 85 2 10 - 28. 5 1. 16 ( mg/ m3 bined standard uncertainty 4 结语 分析结果显示 ,用分光光度法测定水体叶绿素 a ,样品量为 1 L 和 0. 1 L 的测量不确定度 分别为 0. 214 和 2. 32 mg/ m3 . 影响水体叶绿素 a 含量的测量不确定度分量主要是波长在 750 、 、 nm 处吸光度的标准不确定度 ,而测量使用的各种量具则影响甚微 . 影响吸光度 663 645 不确定度的因素贯穿整个测量过程 , 主要来源于研磨 、 离心 、 样品的新鲜度等几个方面 .

28、 为 了确保分析结果的准确可靠 ,样品采集后应及时抽滤 、 分析 ,如不能及时处理则应在低温避 光处保存 ,并加 1 %碳酸镁粉悬浊液保鲜样品 . 在叶绿素 a 提取步骤应充分研磨 ,离心转速应 达到规定的 30004000 r/ min. 提取液在 750 nm 的吸光度应控制在 0. 005 以下 ,否则将对测 量结果产生明显影响 . 致谢 : 原国家标准物质研究中心罗涤明老师对本文的计算过程进行了指导 ,特此致谢 ! 参考文献 : 1 ISO21993. Guide to the Expression of Uncrertainty in Measurement S . 2 F10592

29、1999. 测量不确定度评定与表示 S . JJ 3 F100121998. 通用计量术语及定义 S . JJ 5 国家环保局 . 环境监测技术规范 S . 1986. 17218. 4 ISO/ IEC1702521999. General requirements for the competence of testing and Calibration laboratories S . 7 金相灿 ,屠清英 . 湖泊富营养化调查规范 M . 北京 : 中国环境科学出版社 ,1990. 2682270. 6 国家环保总局 . 水和废水监测分析方法 ( 第 4 版 M . 北京 : 中国环境

30、科学出版社 ,2002. 6702671. 合成标准不确定度 Com2 uc ( C1 32 仲恺农业技术学院学报 第 16 卷 The evaluation of uncertainty in measuring chlorophyll a with spectrometry Y Wen2yong , HU Di2qin , NIAN Ji , LI YING wen , ZHU Da2ming U 2 ( Guangzhou Enviromental Monitoring Center , Guangzhou 510030 , China Abstract : Using spectrom

31、etry to measure chlorophyll a of lake , reservoir , and evaluating its uncertain2 ty. According to alga amount of water , we choosed 2 sample volume ( 1 L and 0. 1 L . Impacting fac2 tors of measuring uncertainty include : the amount of the sample water , the samples handling before tainty regulatio

32、ns to establish the mathematics mode and calculate each standard uncertainty , we got combined standard uncertainty ( uc and expanded uncertainty (U . Results of U were : 0. 214 mg/ m3 ( 1 L of sample volume ,2. 32 mg/ m3 ( 0. 1 L of sample volume . Key Words : spectrometry ; chlorophyll a ; water ;

33、 uncertainty of measurement ( 上接第 24 页 with butachlor and atrazine with different concentrations , and with water as control . The results showed that cocozelle seed germination rate decreased with increase of concentrations of the chemicals when the the fine sands were treated with 10 ,20 ,50 and 100 g/ L butachlor and atrazine , respectively. Compared germination rate was observed. When the seedlings in trifoliate period were sprayed with 10 ,20 ,50 , with control , a significant difference of the effect of the chemicals with different concentrations on seed 100 ,150 and 200 mg/ L butachl