DNA的分离纯化及测定

1、第一章 DNA的分离、纯化及测定第一节 DNA的提取 一、提取程序的原理植物DNA的提取程序应包括以下几项；1，破碎(或消化)细胞壁释放出细胞内容物。然而许多操作在破壁的同时也会剪切DNA，因此任何方法都是在DNA的完整性和产量这两个方面之间折衷考虑的结果。分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉，或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉。分离核DNA或细胞器DNA时则应采取较为温和的破壁方法，以免过早破坏内膜系统，人们通常采用在含有渗透剂的缓冲液中4oC匀浆的方法来破壁。 2、破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中。这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB

2、一类的去污剂来完成。去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子镁离子。3、去除RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。剧烈振荡或小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA 。一般说来，如果操作得当，可以得到相对分子质量长度为50l00kb的DNA。在DNA粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖、丹宁和色素等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase A除去。但多糖类杂质一般较难去除，

3、这些杂质浓度高时，常常使DNA提取物呈胶状，更为重要的是即使是低浓度情况下它们也会干扰后续操作，如抑制某些DNA修饰酶包括限制性内切酶的活性，从而阻碍Southern杂交或基因克隆；同时多糖杂质还会影响分光光度法对核酸的定量分析等。（植物分子生物学-实验手册 （英） Clarke M. S. 主编 顾红雅 瞿礼嘉 主译 高等教育出版社 1998 ）二、基因组DNA的提取1、基因组DNA用途DNA是遗传信息的载体，是重要的生物信息分子, 是分子生物学研究的主要对象。为了进行测序, Southern杂交|, 基因文库的构建，PCR扩增等，高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提. 2、基因组

4、DNA提取的原则保证提取的DNA具有一定的长度纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质,多糖,脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染 3、基因组DNA- CTAB法 CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)CTAB( hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵), 是一种阳离子去污剂, 具有从低离子强度 (0.3mol/L NaCl) 溶液中 沉淀核酸与酸性多聚糖的特性, 在高离子强度的溶液中( >0.7mol/L NaCl), CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物, 只是不能沉淀核酸. 通过有机溶剂抽提,

5、 去除蛋白, 多糖, 酚类等杂质后 加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl（三(羟甲基)氨基甲烷）(pH8.0) 提供一个缓冲环境, 防止核酸被破坏; EDTA 螯合Mg2+ 或Mn2+ 离子, 抑制DNase活性; NaCl 提供一个高盐环境, 使DNA充分溶解, 存在于液相中; CTAB溶解细胞膜, 并结合核酸, 使核酸便于分离; -巯基乙醇 是抗氧化剂, 有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除CTAB提取缓冲液的改进配方 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物, 能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除 多酚, 减少DNA中酚的污染; 同时它也能

6、和多糖结合,有效去除多糖. ( From web modified )方法1液氮1×缓冲液： 50 mmol /L Tris-HCl pH 8.0 ,0.7mol /L NaCl,10 mmol /L EDTA pH 8.0 ,1% CTAB,20 mmol /L 2-巯基乙醇（用前加入）氯仿/异戊醇（24：1） RNaseA : 2000U / mL 用0.15 mol/L NaCl, 0.015 mol/L 柠檬酸三钠配10mg/mL; 使用前100 热处理15min , 除去残留的DNase活性异丙醇，76%乙醇，0.2 mol/L乙酸钠70%乙醇TE缓冲液: 10 mmol/

7、L Tris-HCl 1 mmol /L EDTA pH 8.0 ,操作程序1. 向装有700800 mg 磨碎的 干燥植物组织 （ 冰冻干燥法， 或用食品脱水器45 55用温暖干燥的气流对植物组织处理12h 以上）（最好是去淀粉处理的：收获之前将植株暗处理24 h）的50mL聚丙烯离心管中加入20mL 65 预热的1×CTAB提取缓冲液。轻轻转动离心管使植物组织在提取缓冲液中均匀分散，65 温育90min, 并不时轻轻转动离心管。 或者， 将10g 经去淀粉处理的新鲜植物材料用液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，在化冻之前将粉末转移至一50mL聚丙烯离心管中，然后加入20mL 预热至9

8、0的2×CTAB提取缓冲液（CTAB在低于15时会析出沉淀，因此在将其加入到冷冻的材料中之前必须预热）。轻轻转动离心管，混匀，然后置于65 温育90min。2混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇。轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液。室温下5000 g 离心10 min分相。3将上清液（水相）转移至一干净离心管中，加入1/100体积RNaseA贮液，颠倒混匀37保温30min。4加入0.7体积异丙醇，仔细混匀，室温放置15min沉淀DNA。5用一玻璃钩将DNA钩出（最适条件下，DNA-CTAB沉淀呈白色纤维状，很易钩出，若有多糖等杂质时呈絮状或胶状，需离心得到DNA-CTAB沉

9、淀；2% W/V PVP聚乙烯吡咯烷酮 有助于去除多酚类杂质），并转移至一装有5mL 76%乙醇，0.2 mol/L乙酸钠的干净离心管中，冰上放置20min，然后转移至一装有5mL 76%乙醇的离心管中冰上旋转5min。 6将DNA转移至一干净离心管中，空气干燥15min ，溶于尽可能少的TE缓冲液中（5 mL左右）。若要使DNA样品加速溶解并除去其中残留的DNase活性，可置于 65 水浴加热10min。4贮存。（植物分子生物学-实验手册 （英） Clarke M. S. 主编 顾红雅 瞿礼嘉 主译 高等教育出版社 1998 ）方法2CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium

10、 Bromide 十六烷基三甲基溴化铵)是一种去污剂它能跟核酸形成复合物，这些复合物在高盐溶液(0.7mol/L NaCl)中可溶并且稳定存在、但如果降低盐的浓度(0.3mol/L NaCl)，CTAB与核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀出来。而大部分的蛋白及多糖仍溶于溶液中，通过离心将 CTAB- 核酸沉淀下来，然后溶于高盐溶液中，最后通过CsCl离心去除所有蛋白、多糖、寡聚核苷酸等不纯物。抽提缓冲液（2×） CTAB ( W/V) 2% Tris-HCl(pH 8.0) 100mmol/l EDTA 20mmol/l NaCl 1.4mol/l 巯基乙醇 2%10% CTAB溶液

11、NaCl 0.7mol/l CTAB 10% 沉淀缓冲液CTAB 1%Tris-HCl(pH 8.0) 50mmol/lEDTA 10mmol/l 巯基乙醇 1% CsCl梯度溶液（每梯度） CsCl 25gTE缓冲液( pH 8.0) 25ml溴化乙锭（(EB) 5mg/mlTE缓冲液: Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA 1 mmol /L 异丙醇溶液：向装有一定量异丙醇的瓶中加入TE缓冲液直至两相出现，然后边搅拌边加入固体CsCl，至下层TE相中出现白色沉淀，两相均匀待用液氮 氯仿/异戊醇（24/1）异丙醇2%巯基乙醇氯仿还能加速有机相与液相分层。去除植物色

12、素和蔗糖在氯仿中加入少许异戊醇的目的在于减少蛋白质变性操作过程中产生气泡。最后用氯仿抽提处理，是为了去除核酸溶液中的迹量酚。实验程序（1） 取10g50g 新鲜植物材料，先置液氮中速冻半分钟，转至研钵中研磨成细粉末。（2） 将细粉末转至一个250ml的离心管中，先加入1050ml的2%巯基乙醇，再加等体积的煮沸的抽提缓冲液（2×），迅速混匀。（3） 将离心管置55 水浴中保温，可轻轻搅动混合物，使离心管内温度达到50 ，然后让混合物降至室温。 （4） 加等体积的氯仿/异戊醇（24/1），轻缓地颠倒混匀，室温下12000 g离心10分钟，上清转至另一新离心管中。（5）向离心管中加入1/

13、10体积的10% CTAB溶液， 再重复第4步一次。（6）向离心管中加入等体积的沉淀缓冲液，混匀，室温下放置至少30分钟，4000g离心10分钟，小心去上清，加CsCl梯度溶液，在50 水浴中用枪头轻缓搅溶沉淀。（7）将梯度溶液上到超速离心管中，平衡后封好管，在20，50000g条件离心过夜。（8）在紫外灯下转移DNA带至一离心管中，加入等体积的异丙醇溶液，轻轻混匀后静置，分层后弃上层；重复抽提几次，直至紫红色消失。（9）加两倍体积的TE缓冲液，混匀后加等体积的异丙醇，-20放置1小时，4条件下12000g离心30分钟，沉淀溶于TE缓冲液中。（10）向其中加入1/5体积的3mol/l NaAc

14、(pH6.0)和3/5体积的异丙醇，混匀，在室温下放置510分钟，离心后沉淀溶于适量TE缓冲液中。（11）用紫外分光光度仪检测DNA含量。（8）是去除EB, 异丙醇溶液也可用氯化钠饱和。 CTAB法提取真菌基因组DNA2×CTAB提取缓冲液 (使用前在 55 or 65oC预热)2% (w/v) CTAB (Hexadecyltrimethylammonium Bromide, Sigma # H-5882 =cetyltrimethylammonium bromide)100 mM Tris-HCl (pH 8.0)20 mM EDTA (pH 8.0)1.4 M NaClopti

15、onal: add 1% mercaptoethanol before using (I usually do no add MCE)1 取干菌丝（80oC保存）放入研钵，加液氮后，研磨成粉末。2 将粉末转到离心管中，加入2×CTAB提取缓冲液 (使用前在 55 or 65oC预热)。 （1g 加20 ml）。3 65oC保温30 min4 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），混匀，轻轻转动20 min。5 4,000 rpm 离心5 min.6 取上清液于另一离心管，加RNaseA（5-50g/ml）37oC保温30-60 min。7 加入酚：氯仿（1:1)，轻轻来回颠倒5 min

16、. 8 4,000 rpm 离心5 min.4oC。9 加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），轻轻转动5 min。10 取上清液于另一离心管，加入2倍体积100% 乙醇或 0.6-1×异丙醇。11 10,000 rpm离心10 min.4oC 12. 5-10 ml 70% 乙醇洗一次。13 风干DNA， 用DDW or TE缓冲液溶解。 三、细胞核、线粒体、叶绿体DNA的提取 1、细胞器差速分离： 2、从分离的细胞核中提取DNA 多酚类或多糖类含量较高的植物而言，用上述基本程序提取的DNA其纯度恐难以满足后续研究的要求。一个解决办法就是在裂解之前将细胞核同其他大部分细胞质分开。下述分

17、离完整细胞核的方法(Henfrey和Slater l988), 适用于新鲜的植物材料。它包括 选定对核膜伤害最小的条件破碎细胞，滤去细胞碎片，滤液经缓速离心富集细胞核。从分离的细胞核中提取的DNA通常质量和纯度都较高，其中主要是核DNA，当然也可能混有一些细胞器DNA，特别是叶绿体DNA。从分离的细胞核中提取DNA，得率较低，一般为1020g/g鲜重材料。核分离缓冲液（NIB）：0.44mol/L 蔗糖，2.5% Ficoll (相对分子质量400000)，5% Dextran 40 ，25mmol/L Tris-HCl pH 7.6，10mmol/L氯化镁，10mmol/L 2-巯基乙醇（用

18、前加入）核裂解缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA, 0.5% Triton X-100, pH7.2. Miracloth 纱布NIB: nuclear isolation bufferFicoll 聚蔗糖 Dextran葡聚糖 Triton x-100 非离子型表面活性剂步骤14中所需的试剂和仪器均须预冷至4以降低内源蛋白酶和核酸酶的活性。1将10 g 经去淀粉处理的新鲜材料剪碎，放入研钵中，加入10mL NIB 磨碎匀浆。2匀浆用4倍体积NIB稀释后经双层Miracloth纱布过滤（Miracloth纱布预先用NIB浸湿）。用5倍体积NIB冲洗Mirac

19、loth纱布上的残留物。3滤液分装于两个50 mL聚丙烯离心管中， 500g , 4离心10min. 弃上清。4用总体积20 mL NIB 重悬沉淀，合并，500g , 4离心10min. 弃上清。5用6 mL核裂解缓冲液重悬上述细胞核粗沉淀，加入6 mL预热至65的2×CTAB提取缓冲液，轻轻旋转混匀，65保温1h, 偶尔轻轻旋转。6以下操作按基本CTAB方法从第2步开始。去淀粉处理：收获之前将植株于暗处放置24h即可达到去除淀粉的目的。（植物分子生物学-实验手册 （英） Clarke M. S. 主编 顾红雅 瞿礼嘉 主译 高等教育出版社 1998 ）3、叶绿体DNA的提取 分离

20、植物叶绿体DNA的方法与分离核DNA的方法比较类似也包括以下几个主要过程：植物细胞的破碎，去除细胞核，然后用中速甩下叶绿体，经清洗和DNase处理后即可用常规的沉淀核DNA的方法将叶绿体DNA沉淀下来。 细胞器分离缓冲液：Sorbitol 300mmol/lTris-HCl (pH8.0) 50mmol/lEDTA 5mmol/lBSA 0.1%-巯基乙醇（V/V） 0.1%DNase缓冲液：Sorbitol 300 mmol/lTris-HCl (pH8.0) 50 mmol/lEDTA 5 mmol/lBSA 0.1%-巯基乙醇（体积比） 0.1%MgCl2 13mmol/lDNase I

21、 250g/ml细胞器清洗缓冲液： NaCl 150 mmol/lTris-HCl (pH8.0) 50 mmol/lEDTA (pH8.0) 25 mmol/l裂解缓冲液：Tris-HCl (pH7.2) 50 mmol/lEDTA 20 mmol/lSarkosyl溶液： Tris-HCl (pH7.2) 50 mmol/lEDTA 20 mmol/lSarkosyl 20%0.5mol/l EDTA (pH8.0) 52%和30%蔗糖Sorbitol 山梨醇 sarkosyl (N-十二烷基肌氨酸钠)是一种比较强的阴离子去垢剂牛血清白蛋白(BSA) 能包在细胞外面，并作为竞争性底物削弱蛋

22、白酶的作用。实验程序 (1) 将一定量的植物叶片剪成小片(愈伤组织切割成小块)，置于400 ml预冷的细胞器分离缓冲液中用匀浆器以中等速度匀浆12分钟，然后将匀浆液用4层灭菌的纱布和1层Miracloth过滤至一灭过菌的1升烧杯中。 (2) 将过滤后的匀浆液移至离心管中，以700g的速度4条件下离心10分钟，去沉淀；上清移至另一离心管中，4条件下2000g离心10分钟，去上清。 (3) 将沉淀悬浮于25ml DNase缓冲液中，冰上放置1小时加0.5mol/l EDTA溶液至终浓度为20 mmol/l，然后在4条件下2000g离心15分钟。 (4) 将沉淀悬浮于30ml细胞器分离缓冲液中，待用

23、 (5) 用50ml离心管制4个蔗糖梯度，每一梯度的制法为：底都为18ml的52蔗糖、50mmol Tris-HCl( pH8.0)和25mmol EDTA混合液，上面盖上7ml 30蔗糖、50mmol Tris-HCl( pH8.0)和25mmol EDTA混合液。 (6) 将第4步中悬浮的沉淀7.5ml小心地分别上于一个梯度离心管中，平衡后以25000 r/min速度在4离心30分钟。 (7) 用宽口大枪头从5230蔗糖界面上吸取叶绿体条带，置于250ml烧杯中。缓缓地用三倍体积的预冷的细胞器分离缓冲液稀释，然后将液体移置适当大小的离心管中，4条件下以2000g离心15分钟。 (8) 沉淀

24、悬浮于25ml细胞器清洗缓冲液中，4条件下以2000g离心15分钟。 (9) 将每份沉淀悬浮于5ml裂解缓冲液中，在水上边摇晃边滴入20的Sarkosyl溶液，至终浓度为1。 (10) 将裂解的叶绿体上一个CsCl/EtBr密度梯度，即可获得较纯的叶绿体DNA。4、植物线粒体DNA的分离分离植物线粒体DNA，首先就要分离出线粒体，然后再从线粒体中分离DNA。提取的过程主要包括破碎细胞、差速离心、梯度离心、盐沉淀等。1 mol/l CsCl/ EtBr溶液CsCl 1 mol/l Tris-HCl (pH8.0) 50mmol/lEDTA 10mmol/lEtBr 0.2mg/ml7mol/l

25、CsCl/ EtBr溶液CsCl 7 mol/l Sarkosyl 0.1%EtBr 0.2mg/mlCsCl 饱和的异丙醇0.5mol/l 的EDTA溶液 (pH8.0)3mol/l NaAc实验程序:(1) 将一定量的植物叶片剪成小片(愈伤组织切割成小块)，置于400ml预冷的细胞器分离缓冲液中用匀浆器以中等速度匀浆12分钟，然后将匀浆液用4层灭菌的纱布和1层Miracloth过滤至一灭过菌的1升烧杯中。(2) 将过滤后的匀浆液移至离心管中，以700g的速度4条件下离心10分钟，去沉淀；上清移至另一离心管中，4条件下2000g离心10分钟，再去沉淀，上清再移至另一离心管中、4下以10000

26、g速度离心15分钟，去上清。 (3) 将沉淀悬浮于25ml DNase缓冲液中，冰上放置1小时加0.5mol/l EDTA溶液至终浓度为20 mmol/l，然后在4条件下10000g离心15分钟。 (4) 沉淀用25ml冲洗缓冲液悬浮并再次在4条件下10000g速度离心15分钟 (5）沉淀用5ml裂解缓冲液悬浮置冰上然后向其中滴入20的Sarkosyl溶液至终浓度为1，4条件下500g低速离心5分钟上清移至一离心管中。 (6) 先向离心管中加入一定量的1moll CsCl/EtBr，55水浴中保温5分钟，然后加入前者体积1.2倍的7 moll CsCl/EtBr将离心管盖好封上，缓慢倒置混匀。

27、 (7) 以40000r/min速度在4离心16小时或更长，在320nm紫外光下观察DNA带，在DNA带管壁旁用单面刀片划一道小口子，然后用带针头的注射器穿刺进去抽出DNA带。 (8) 加入等体积的CsCl饱和的异丙醇去除EtBr，水相再置于透析袋中4透析24小时以上2升的去离子水至少换三次并用磁力搅拌器搅拌。 9) 在260nm测A值计算DNA样品的量。加入0.1体积的3mol/l NaAc和2体积冷的无水乙醇置-20过夜。 (10) 10000rmin离心10分种，沉淀经真空抽干后溶于适量体积的水中，电泳检查。 植物基因与分子操作 顾红雅 1995年04月第1版四、质粒DNA的提取碱变性质

28、粒DNA抽提法 碱变性质粒DNA抽提法是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性差异来达到分离质粒DN A的目的的。在强碱条件下染色体DNA氢键断裂双螺旋结构解开而变性；质粒DNA大部分氢键也断裂，但由于其螺旋共价闭合环状的结构两条互补链不会完全分离、当体系的pH从碱性调至中性时，两条链即复性，质粒DNA即以原来的构型保存在溶液中.而染色体DNA不能很快复性，只能形成缠连在一起的网状结构；这时一离心，染色体DNA就与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS 复合物等杂质一起沉淀下来而被除去。质粒DNA在溶液中以水合状态稳定存在，用乙醇沉淀的方法即可获得纯的质粒DNA。如果要提高质粒DNA的纯度、最好

29、再在提取过程中加上加RNase降解小分子RNA、加苯酚氯仿抽提蛋白和加PEG沉淀等步骤。大致可分为从菌体染色体DNA中分离质粒DNA、去除RNA和去除蛋白质等杂质三大步骤，实验中采用的各种试剂成分均有其生化功能。溶液I：溶菌酶 用于水解菌体细胞壁的主要化学成分，具有溶菌作用。葡萄糖 是为了增加溶液粘度，以防止染色体DNA受机械剪切力作用而降解、污染质粒。EDTA 一是抑制DNase对DNA的降解作用，因为EDTA是一种金离子鳌合剂，DNase作用时却需要一定的金属离子作辅基；二是保证溶菌酶有一个良好的低离子强度的环境。溶液II：NaOH 可促使染色体DNA及质粒DNA强碱变性。SDS 则是表面

30、活性剂，功能是破坏膜、解聚核蛋白以及形成蛋白质变性复合物以利于沉淀。溶液III KAcHAc缓冲液它使变性的质粒DNA复性并稳定存在。 溶液I：葡萄糖 50mmol/lTris-HCl (pH8.0) 25mmol/lEDTA 10mmol/l溶菌酶 4mg/ml溶液II (新配制) ： NaOH 0.2mol/l SDS 1%溶液III （100ml, pH4.8）：KAc 29.4g 冰醋酸 11.5ml水 加至 100mlTE缓冲液: Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA(pH 8.0) 1 mmol /L氯仿/异戊醇（24/1）RNase (10mg/ml)

31、无水乙醇和70%乙醇 异丙醇 4mol /L NaCl 13% PEG8000实验程序 (1) 取单个细菌菌落接种到5ml 含有50g/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37过夜。 (2) 取1.5ml × 3培养液至Eppendorf管中，7000g离心2分钟 ，去上清液。 (3) 将沉淀菌悬浮于200l预先冷却的 溶液I 中，混匀后开盖在室温下放置5分钟。(4) 向管中加入300 l新配制的溶液II，盖上盖子迅速颠倒小管23次混匀，冰上放置5分钟。 (5) 加入300l溶液III，盖上盖子倒置 温和振荡10秒钟，冰上再放置5分钟10000rmin条件下离心6分钟。 6) 上清液转

32、至另一新管中，向管中加入10 l RNase A , 37下保温30分钟。 (7) 加等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提两次12000rmin离心5分钟后上清转至另新管中，加入等体积的异丙醇，混匀后立即在12000rmin条件下离心10分钟。 (8) 沉淀用70乙醇清洗后，自然干燥，溶于40l水中加入8l 4 mol/l NaCl和32l 13PEG8000，混匀后，水上保温1520分钟。 (9) 在12000rmin条件下离心l0分钟， 沉淀经70乙醇清洗后，自然干燥，最后溶于40lTE缓冲液中。 植物基因与分子操作 顾红雅 1995年04月第1版第二节 DNA的纯化及测定一、 氯化铯密度梯度离心法纯化DNA本方法可以从各种方法得到的DNA粗提物中除去大部分的蛋白、RNA、多糖和其他杂质。它对需要使用高纯度DNA的实验，如构建DNA文库十分有用。 氯化铯（分子生物学纯） 溴化乙锭，5mg/mL 氯化铯饱和的异戊醇或异丙醇 3 mol/L 乙酸钠 无水乙醇 70%乙醇 TE缓冲液: 10 mmol/L Tris-