血浆长链非编码RNAH19在原发性肝癌诊断中的价值

1、 2临床检验血浆长链非编码RNA H19在原发性肝癌诊断中的价值孙一奎，赵枫，王峰，王卫华亍波大学医学院附属医院检验科，浙江亍波315020摘要：目的 探讨血浆长链非编码RNA印迹母系表达转录体（H19）在原发性肝primary hepatic carcinoma, PHC ）中 的临床诊断意义。方法 收集并检测180例PHC患者和211例非肝癌患者血浆中HI9、甲胎蛋白（AFP）、谷氨酰皋 转氨酶2（7-GT2）、异常凝血酶原（AP）岩藻糖昔酶（AFU）和碱性磷酸酶-1 （ ALP - 1）的表达水平,Logistic回0和受试左工作（R（）C）曲线分析其待界性、灵敏度等指标。结果H19在P

2、HC患&血浆中的农达水平明显升高差 异有统计学意义（P <0.01） ；H19的AUG值为0. 868,约登指数为0 702 .HI9相对表达水平临界阈值设定为0. 073时, 诊断灵敏度为力.78% 特异度为92.42% ；H19+ AFP的AUC为0.949.灵敏度为86. 11%，特异度为92.42%，约登指 数为0.753,其约登指数最岛；H19 + AFP + 7-GT2联合检测时,AUC可达0.961,灵敏度为91.67%,特异度为91.00%, 约登指数为0.827（,结论 H19在PHC患者中衣达水平明显升高并町作为PHC临床诊断的独立标，忐物；H19 + AEP

3、 + y -G12联合检测具有较好的诊断效能。关键词：肝癌；印迹母系表达转录体；甲胎蛋白；号谷氨酰愿转氨晦2；异常凝血酶原；a-L-岩藻脈昔酶；碱性确破 嗨-1;受试者工作曲线中图分类号：R735.7文献标识码：A 文章编号：10048685（2016）03 - -03Diagnostic value of long non coding RNA H19 in primary hepatic carcinomaSUN Yi -kui, ZHYAO Feng, WANG Feng, WANG Wei - huaClinical laboratory f Affiliated Hospital o

4、f Medical College of Ningbo ( niversity t Ningbo, Zhejiang 315020, China Abstract: Objective To explore the clinical diagnostic value of imprinted maternally expressed transcript - long non coding RNA H19( IncRNA 1119) in serum of primary hepatic carcinoma( PHC). Methods Serum from 18() PHC cases an

5、d 211 non PHC control cases were collected and detected for the levels of H191 AFP. y - GT2f APt AFP and ALP - I. The sensitivity9 specificity, and other related indexes of them were analyzed by logistic regression and ROC curves Results Thu serum H19 expression in PHC patients were significantly el

6、evated than that in the non PHC cases t and the diflerence was statistically signif- icant ( P <0.01) ； the area under the ROC curve (AUC) of H19 was 0. 868, Youden index was 0. 702. When the cutoff point of H19 was set al 0.073. the sensitivity was 77.78% and the spH ificity was 92. 42% When the

7、 AUC of combination H19 xilh AFP was 0. 949, the sensitivity was 86. 11%, and the specificity was 92. 42% , Youden index was the highest as 0. 753. When the AUC of the combined detection of H19, AFP and y - GT2 was up to 0. 961 9 the sensitivity was 91.67% , the sp<n i- ficity was 91.00% . and Yo

8、uden index was 0. 8266. Conclusion The expression of H19 in serum of PHC patients were significantly ek?vat(?d, and may lie viev<(l as an in(le|Mfen(lent diagnostic! tuinor marker of PHC The diagnosticof the conibined detection of H19, AFP and y - GT2 has preieralile diagnostic value in PHC.Key W

9、ords： Primary hepatic carcinoma； H19； AFP； 7 - (7r2； Almormal prothrombin； Alpha - fucosidase； ALP - I ；ROC curve 2 2原发性肝癌（primary hepatic carcinoma, PHC）为 我国常见恶性肿瘤之一,其死亡率在消化系统恶性肿 瘤中居第3位仅次于胃癌和食管癌）冃前临床上常 规物理诊断手段（B超、CT、X线肝血管造影）很难发 现直径< 1 cm的肿瘤，而传统的肿瘤标志物的特异性 和灵敏度也不够奇，差异也很大，不能达到真正意义 上的早期诊断O长链非编码RNA （

10、 long noncoding RNA, IncRNA）是一类转录长度超过200 nt并不编码基金项目：浙江省宁波市自然科学基金项IK2015A610237）作者简介：孙一奎（1981），男本科，主管检验师主婆从事临床 医学检验工作。蛋口的RNA分子，近几年才被关注并逐渐成为研究 热点，_2o IncRNA印迹母系表达转录体（H19）在 PHC中异常表达，可能会成为新熨的持异性和灵敏度 更髙的肿榴标志物，为疾病的早日诊断提供依据。 因此，寻找敏感性更高、特异性更好、与肿瘤的疗效和 预后相关性等方面更理想的肿瘤标志物，具有十分积 极的意义。本研究收集并检测180例PHC患者和 211例非肝癌患者

11、血浆中H19、甲胎蛋白（AFP） - 谷氨酰基转氨酶2（y-GT2）、异常凝血酶原（AP）、 a-L-岩藻糖昔酶（AFU ）和碱性磷酸酶- 1 （ ALP - 1）的表达水平，探讨血浆长链非编码RNA H19在PHC中的临床诊断意义。1资料与方法11资料180例PHC患者及211例非肝癌患者血 浆,均来自2014年1月-2015年6月宁波大学医学 院附属医院门诊及住院患者，所有研究对象均知情同 意，诊断标准均根据中国常见恶性肿瘤诊治规范第 二分册中PHC诊断标准，并经术后病理证实为 PHC01.2 仪器与试剂 OLYMPUSAU640全自动生化分 析仪（OLYMPUS OPTICAL Co.

12、, Ltd. ） ；AB17900 荧光 仪（广东华运仪牛物工程有限公司）。AFP试剂 盒（批号：523631）；y_GT2、AP、ALP 和 AFU 试剂盒 （批号：20150601 ）；RNA提取试剂（批号:10296 - 028）；逆转录试剂盒（PrimeS<ript® RT）；荧光 PCR Mix（批号：4304437 ）o13方法AFP采用电化学发光免疫法，使用仪器 为罗氏E2010电化学发光分析仪。y-（；T2、AP、 ALP - 1和AFU采用酶速率法。阳性判断标准: AFP400-GT2M64 U/L, ALP -1120 U/L,AFU>35 U/L,A

13、Pm200 U/L。血浆中 1119 和甘油醛- 3-磷酸脱氢酶（GAPDH）内参基因的表达水平，采用 TaqMan实时逆转录荧光PCR方法，在ABI7900荧光 PCR 仪上检测。使用 Primer - Blast 和 Primer Express 3.0软件设计引物及探针（表1 ），所有核昔酸均在ln- vitrogen公司合成）表1引物序列引物名称引物序列（5，-3，）退火温度（七）产物长度（bp）H19-FGACTCAGGAATCGGCTCTGG593081119-RACAGAGTCGTGGAGGCTTTG-FACCACAGTCC.KTGCCATCAC59452GAPhHTCCACCA

14、CCCTGTTGCTGTA注:F衷示上游引物;R农示下游引物1.4 统计学处理 采用 SPSS 16. 0 .GraphPad PRISM 5.0和MedCalc software 11.5.0统计软件进行数据分 析。非参数Wilcoxon秩和检验比较组间血浆H19水 平;逐步回归变量筛选和Logistic回归对H19进行多 变量分析;ROC曲线评价H19、AFP、AP、AFU、ALP-1 和了-GT2诊断PHC敏感度和特异度使用ROC曲 线下面积（AUC）比较各指标的诊断能力；根据PHC 中的ROC曲线确定诊断临界值（cut -off值）；以95% 为可信区间,P<（）.（）5为差异具

15、有统计学意义。2结果2.1 血浆中H19及常见肿瘤标志物表达水平 PHC 患者血浆样本中，H19、AFP、AFU、ALP-1、AP及丫 - CT2的表达水平高于非肝癌患者，差异冇统计学意义 （P<0.01）（表 2）。 2 2表2 PHC患者与非肝癌患者的血浆1119及當见肿瘤标志物表达水平中位数（P25.P75）组别例数（例）1119AFP( pLg/L)AFU(U/L)AIT - 1 ( U/L)PHC患者1800.11(0.08,0.15)572.56(302.76,1096.73)36.46(26.70,50.86)146.68( 1(651.229. 19)非肝癌患者2110.

16、04(0.03,0.05)58.20(30.94,148. 14)18.57(15.05,25. 16)87.04(57.80,110.70)P值<0.01<0.01<0.01<0.01 2 2续表组别例数（例）AP( U/L)7-GT2(U/L)PHC患者180247.32(164.40 310.88)70.20(44.56.89.98)罪肝癌患者21196.28(57.03,142.86)33.71(21.74,49.15)P值<0.01<0.012.2 H19与其他常用PHC标志物单项检测的ROC分析 H19、AFU的AUC值分别为0.868.0.81

17、9,约 登指数分别为0.702、0.566,AFP与H19的AUC及约 登指数较大且两者相近。当H19相对表达水平临界 阈值设定为0.073时,诊断灵敏度为77.78%,特异度 为92.42% （表3）。H19相对表达水平在0.073以上 诊断为PHC。表3 1119与人他常用PHC标志物"I页检测的ROC分析标怎物AUC灵敏度（）特异度（）约登指数11190.86877.7892.420.702AFP0.92696.6777.250.739AFU0.81981.6774.880.566ALP-10.82766.6789.570.562AP0. 82782.7877.730.6057

18、 - GT20. 84267.7884.830.5262.3 H19与其他常用PHC标志物的Logistics分析及联合检测的ROC分析 逐步logistic回归分析预测 变址的ROC曲线分析检测删除了 AFU和APO H19 + AFP的AUC为0.949,灵敏度为86. 11%,特异 度为 92.42%,约登指数为 0.785。H19 + AFP + 7 -3GT2的联合检测诊断符合率较高，其AUC、灵敏度、特 异度、约登指数分别为0. 961.91. 67% .91. 00%、 0. 827 ；而1119 + AFP十ALP - 1联合诊断效能要比 H19 + AFP + ALP - 1

19、 + 7 - (VV2联合诊断效能更高,差 异有统计学意义(/*0.01)(表4)。表4 H19和AFP联合其他常用PHC的ROC分析标吉物AIC灵敏度(%)持异度(%)约谯指数H19 + AEP0.94986. 1192.420.785H19 + ALP-10.9048L 1191.000.721Hi9+7-GT20.91576. 1196.210.723AFP + ALP - 10.94594.4480.570.750AFP + 丫 - GT20.95289.4486.260.7571119 +AFP+ V-GT20.96191.6791. (X)0.8271119 + AEP + ALP

20、 - 10.95388.8989.570.785H19 + AEP+ ALP - 1 + 7 - GT20.96389.4492.420.8193讨论非编码RNA依据长度可以分为两大类：短片段 非编码RAN(包括siRNA、miRNA、piRNA)和长片段 非编码RNA(lncRNA),0前的研究主要集中于短片 段 ncRNA，女口 microR 2NA 和 siRNAl4_5,并已有关于 多种动植物基因组中microR 2NA的研究报道， 尽管如此，当前对于长片段neKNA的报道也越来 越多0 IncKNA并不编码蛋白，而是以BNA的形式在 表观遗传、转录以及转录后水平等多种层面上广泛参 与

21、基因表达凋控，影响肿瘤的发生、发展，并且与肿瘤 段袭、转移及患者预后密切相关。深入研究IncKNA 与肿瘤发病的关系有望为肿瘤的预防和诊治提供全 新的思路：，2-，31oH19是第一个被发现的肿瘤相关IncRNA ,4,在 进化上具有高度的保守性。人出生后大多数组织的 表达趋于停止，仅在骨骼肌和心肌有一定的表达，而 当机体组织再生或形成肿瘤时可被重新激活。据报 道 ，H19在胃癌、结直肠癌、肝癌及膀胱癌等中 异常表达,发挥促癌作用。儿讪等研究发现凶，不但 在血浆中检测到H19,并且通过实验证实血浆中的 H19稳定存在,适合作为常规检测。本研究检测血浆 中的IncRNA H19,在180例PHC

22、患者血浆中进一步 证实了其高表达，说明H19在PHC中具有潜在的诊 断意义。临床上以AFP为基础的常用PHC的肿瘤标志物 AFU、ALP-1、AP和7-GT2在临床诊断时，都存在 着不同程度的假阳性率或灵敏度不高的缺陷，因此, 为提高PHC的诊断敏感性，肿瘤标志物联合诊断通 常能够更有效地筛选和诊断肿瘤本研究结果显示, 在检测单指标时，相对于其他PHC标志物，H19与 AFP的AUC及约登指数最大且两者相近，都具有较 高的诊断灵敏度和特异度，1119的诊断能力与ALP - 1 和了 -(；T2无差异，但其灵敏度和持异度都比ALP - 1 和-GT2髙，同时H19与AFU、AP相比，差异具有 统

23、计学意义。因此，与AFP.ALP-1和Y-GT2类似, PHC患者血浆中游离H19的表达水平检测，可作为 PHC诊断的冇用指标。通H Logistics分析后，本研究表明H19 + AFP + 丫 -GT2联合检测诊断效能优于各单项或双项指标检 测的诊断效能，且与以H19 + AFP为皐础的联合应用 ALP - 1或/和7 - GT2诊断能力相近，但H19 + AFP + 7-GT2联合检测约登指数最大，说明H19 + AFP + 了 - GT2的联合检测对提高PHC的敏感性和准 确率具有更髙的诊断价值。综上所述，H19可做为诊断PHC独立有冃的肿 瘤标志物，但H19及现有临床常用PHC血浆肿

24、瘤标 志物各指标单独应用诊断PHC都有一定局限性, H19 + AFP + 7-GT2联合检测具有较好的互补作用, 可以显著提髙PHC诊断的灵敏度和持异度，减少漏 诊率，因此，以血循环H19水平升高为基础的联合分 析为PHC提供了更准确的诊断方法。参考文献1 Qi Pw Du X. The long non coding RNAst a new cancer diagnostic and lh<kra|MMitic gold mine J. Mcxl Patholt 2013, 26(2)： 155 - 1652 李琪儿.LNC RNA：肿痞分子诊断中的一颗新星J中国生物 化学与分子生物

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