SOD工程菌的构建实验报告

1、.生物工程综合实验- SOD 工程菌构建实验报告集班级 生物工程 1411 学号Word 资料苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验实验室学生守则一、格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。二、格按照实验要求，做好实验预习 ,实验之前 5 分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事地完成实验报告，杜绝弄虚作假。三、格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。五、持实验室的肃安静，

2、不得大声喧哗、嘻闹，禁在实验室抽烟和吃东西。六、防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室外的清洁卫生工作，经指导老师可后，可离开。苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验预习报告名称日期SOD 工程菌构建201712.11-12.13实验目的和要求：工程菌是利用基因工程的法，将外源基因导入到适当的受体细胞株中，使其得到高效表达。这种经改造后的细胞株称为工程菌。工程菌在基因工程药物、污染治理、生物能源能多面具有重要作用。SOD（超氧化物歧化酶），是一

3、种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新代过程中产生的有害物质。人体在不断地补充SOD 后会具有抗衰老的特殊效果，被卫生部批准为具有药物功能的物质。因此，采用工程菌的原理和法，体外大量合成SOD ，有利于降低其生产成本，扩大使用围。了解PCR 的原理和实验流程。了解质粒提取的原理和法。了解酶切的原理和法，单双酶切的区别，粘性末端连接和平端连接的差异。 了解 CaCl2法制备大肠杆菌DH5 感受态及转化的原理。 了解 SDS-PAGE 检测蛋白质的原理和法。实验材料： pCM-T-SOD 质粒、 Taq DNA 聚合酶、 SOD 特异性引物、 dNTPsPET-32A 质粒、质粒提取试剂盒 SO

4、D 基因（ PCR 回收产物）、PET-32A 质粒、 EcoRV 和 HindIII 限制性切酶大肠杆菌DH5 ，1M 预冷的 CaCl2 溶液，LB 培养基，30%甘油，氨苄青霉素转化成功的菌液， 蛋白上样缓冲液， Tris-Hcl，10% SDS， TEMED，10% AP （过硫酸铵），30% 丙烯酰胺单体（ 29 ：1）主要仪器：PCR 仪 水平凝胶电泳仪摇床、超净工作台、离心机、干燥培养箱垂直电泳系统、水浴锅主要步骤：一 .PCR 扩增 SOD 基因及胶回收纯化PCR 扩增1. 在 PCR 管中，加入如下 PCR 反应物：名称体积（l）10× Taq buffer5SOD

5、 上游特异性引物1苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验SOD 下游特异性引物1dNTPs1.5质粒模板3Taq 聚合酶0.5无菌水38总体积502.PCR 反应条件955min9530s5530s30 个循环721min7210min4Pause2. 1% TAE 凝胶电泳A. 胶回收 PCR 产物1） 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，若得到目的条带可进行大批量PCR，回收目的片段；2）通过把切取含 DNA 片段的琼脂凝胶装在1.5 mL小离心管中，称其重量近似地确定其体积， 每 100mg 琼脂凝胶相当于 100 L 体积。称量每次切取含DNA 片段的琼脂糖凝胶加入等体积的溶

6、液BD；3） 55 65 水浴 710 min 直至胶完全融化，期间振荡3 次，琼脂糖必须完全融化；4） 将溶液置于 DNA 纯化柱中，静置2 min ，12000 rpm离心 60 s；若一次加不完，可分两次离心，弃滤液；5） 加入 500 L 溶液 PE（初次使用前用无水乙醇按1：4 稀释）于离心柱中， 12000 rpm 离心 60 s，弃滤液；6） 用溶液 PE 500 L 再洗一遍， 12000 rpm离心 60 s，弃滤液； 12000 rpm再次离心 2 min ，以甩苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验干剩余液体；7） 将离心柱置于新的离心管中，加入60 预热的

7、 30 100 L 溶液 Eluent 于纯化柱中（硅胶膜中央），静置 2 min ，12000 rpm离心 60 s，管底即为回收DNA8） 重复步骤 7；9） 无菌水溶解 DNA ，贮存于 -20 。二 PET-32A 质粒提取1.取过夜菌 1.5 毫升， 5000g离心 1 分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3 毫升过夜菌沉淀。2. 每管加入 250 微升溶液 I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3. 每管加入 250 微升溶液 II，轻轻颠倒离心管 4-6 次，使细菌完全裂解，溶液透明。4. 每管加入 350 微升溶液 III，随即颠倒离心管 4-6 次混

8、匀，可见白色絮状物产生。5. 最高速 (13,000rpm 左右 ) 室温离心 10 分钟。6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱。最高速离心30-60 秒，倒弃收集管液体。7. 在质粒纯化柱加入 750 微升溶液 IV，最高速离心 30-60 秒，洗去杂质，倒弃收集管液体。8. 最高速再离心 1 分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。9. 将质粒纯化柱置于 1.5 毫升离心管上，加入 50 微升溶液 V 至管柱面上，放置 1 分钟。10. 最高速离心 1 分钟，所得液体即为高纯度质粒。11. 0.8% TAE 凝胶电泳检测质粒完整性。三双酶切SOD 基因和 PET-32A 质粒

9、的双酶切及连接A. SOD 基因和 PET-32A 质粒的双酶切1. 在 EP 管中，加入如下双酶切体系名称加入体积（ul ）10 × Buffer M2EcoRV 限制性切酶1苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验HindIII 限制性切酶1SOD 基因 /PET-32A 质8粒无菌水8总体积 20ul2. 上述反应体系， 37反应 2h 。B. 酶切产物的回收C. 酶切片段连接1. 在 EP 管中，加入如下反应体系名称体积（ ul ）10× T4 DNA 连接酶 buffer2SOD 基因酶切片段5PET-32A 质粒酶切片段5T4 DNA 连接酶1无菌水

10、7总体积 20ul2.16， 反应过夜。四 DH5 感受态制备及转化A. 感受态制备1. LB 培养基配制： 称取 10g 胰蛋白胨， 5g 酵母提取物， 10g NaCl ，调节 pH 至 7.2 ，定容至 1L。高温高压灭菌。2.转移 0.1mlDH5 菌液于一只装有 5-8 ml LB 的试管中 . 于 37 °C 下， 250rmp 振荡培养 2 到苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验2.5 小时（检测 OD600 ，控制其在 0.4-0.5 之间）。3.室温下， 4000 rpm 离心 5 分钟收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀。4. 加入 5 毫升冰冷

11、的 CaCl2 溶液，并轻微打匀。5. 4°C 下， 4000 rpm 离心 10 分钟收集细胞。6.加入 0.5ml ( 每 25 ml 初始培养物加入 1ml) 冰冷的 0.1M 的 CaCl2溶液，并轻微打匀。冰浴放置 20min 。7. 此时的感受态细胞可直接进行转化操作， 也可以分装 ,加入 1/10 体积的 30%甘油后于 -70 °C 冰冻保藏。B. 转化1. 向事先灭菌，并经冷处理的 1.5ml EP 管中转移 100ul 感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加入 10ul 连接产物。细心混匀管中成份。于冰浴放置30 到 40 分钟。2.把转化管转移至放于42&

12、#176;C 循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90 秒。（此时不能摇动转化管）3. 把 EP 管迅速转移至冰浴 2 到 3 分钟。 随后向每个 EP 管中加入 500ul LB 培养基。 37°C200rmp 摇菌 45min ，以使细菌复原，并容质粒所编码的抗生素抗性的表达。4.上述反应物 4000rmp离心 2min ，吸弃部分培养基，使剩余体积不超过200ul ，吹打混匀，随后涂布于含有amp的 LB-琼脂平板上。5. 37放置平板直到其上液体被吸收。6.于 37°C 倒置平板培养。转化克隆应该于12-16 小时区间出现。7. 挑取单菌落，置于 6 ml 含有 a

13、mp 的 LB 液体培养基中， 37 250rmp 摇菌培养 8h 。五 SDS-PAGE 检测 SOD 蛋白的表达1. 取 4 ml 转化成功的菌液，加入 1 ml 蛋白上样缓冲液， 100 裂解 10min 。2. 4， 12000rmp 离心 5min ，收集上清。3. 将玻璃板、样品梳冲洗干净，晾干，随后组装玻璃板。苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验4. 按如下体积配制 10%分离胶 8 ml ，混匀：双蒸水3.0ml1.5MTris-HCl2.1mlpH8.830% Acr-Bis2.8ml10% SDS100ul10% AP50ulTEMED5ul5. 向玻璃板间

14、灌制分离胶，立即覆一层双蒸水，大约30min 后胶即可聚合。6. 按如下体积配制 4%浓缩胶 3.0ml ，混匀：7. 将上层双蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。8. 装好电泳系统，加入点击缓冲液，上样 15ul 。9. 调节电压至 80V ，待溴酚蓝跑如分离胶时，调节电压至 120V ，电泳至溴酚蓝刚跑出分离胶。10. 卸下胶板，剥离胶放入染色液中， 室温染色 2h ，加入脱色液，置于摇床中，脱色。期间每 30min更换一次脱色液，至完全脱净。教师签名：实验报告SOD 工程菌构建一、 目的：了解 PCR 的原理和实验流程。了解质粒提取的原理和法。了解酶切的原理和法，单双酶切的区别，

15、粘苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验性末端连接和平端连接的差异。了解CaCl2法制备大肠杆菌DH5 感受态及转化的原理。了解SDS-PAGE 检测蛋白质的原理和法二、原理：工程菌是利用基因工程的法，将外源基因导入到适当的受体细胞株中，使其得到高效表达。这种经改造后的细胞株称为工程菌。工程菌在基因工程药物、污染治理、生物能源能多面具有重要作用。SOD（超氧化物歧化酶），是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新代过程中产生的有害物质。人体在不断地补充SOD 后会具有抗衰老的特殊效果，被卫生部批准为具有药物功能的物质。因此，采用工程菌的原理和法，体外大量合成SOD ，有利于降低

16、其生产成本，扩大使用围。三、实验材料与法1、实验材料与试剂： pCM-T-SOD 质粒、 Taq DNA 聚合酶、 SOD 特异性引物、 dNTPs PET-32A 质粒、质粒提取试剂盒 SOD 基因（ PCR 回收产物）、PET-32A 质粒、 EcoRV 和 HindIII 限制性切酶大肠杆菌 DH5 ，1M 预冷的 CaCl2 溶液， LB 培养基， 30%甘油，氨苄青霉素转化成功的菌液，蛋白上样缓冲液， Tris-Hcl，10% SDS，TEMED，10% AP（过硫酸铵），30% 丙烯酰胺单体（ 29 ：1）2、实验仪器：PCR仪 水平凝胶电泳仪摇床、超净工作台、离心机、干燥培养箱垂

17、直电泳系统、水浴锅3、实验法：一 PCR 扩增 SOD 基因及胶回收纯化PCR 扩增胶回收PCR 产物1） 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，若得到目的条带可进行大批量PCR，回收目的片段；2） 通过把切取含 DNA 片段的琼脂凝胶装在 1.5 mL 小离心管中，称其重量近似地确定其体积， 每 100 mg 琼脂凝胶相当于 100 L 体积。称量每次切取含 DNA 片段的琼脂糖凝胶加入等体积的溶液 BD；3） 55 65 水浴 710 min 直至胶完全融化，期间振荡 3 次，琼脂糖必须完全融化；4） 将溶液置于 DNA 纯化柱中，静置2 min ，12000 rpm离心 60 s；5） 加入

18、500 L 溶液 PE 于离心柱中， 12000 rpm离心 60 s，弃滤液；6） 用溶液 PE 500 L 再洗一遍， 12000 rpm 离心 60 s，弃滤液； 12000 rpm 再次离心 2 min ，以甩干剩余液体；7） 将离心柱置于新的离心管中，加入60 预热的 30 100 L 溶液 Eluent 于纯化柱中（硅胶膜中央），静置 2 min ，12000 rpm离心 60 s，管底即为回收DNA8） 重复步骤 7；9） 无菌水溶解 DNA ，贮存于 -20 。苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验二 PET-32A 质粒提取1. 取过夜菌 1.5 毫升，5000

19、g 离心 1 分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集 3 毫升 过夜菌沉淀。2. 每管加入 250 微升溶液 I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。3. 每管加入 250 微升溶液 II，轻轻颠倒离心管 4-6 次，使细菌完全裂解，溶液透明。4. 每管加入 350 微升溶液 III，随即颠倒离心管 4-6 次混匀，可见白色絮状物产生。5. 最高速 (13,000rpm 左右 ) 室温离心 10 分钟。6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱。最高速离心30-60 秒，倒弃收集管液体。7. 在质粒纯化柱加入 750 微升溶液 IV ，最高速离心 30-60 秒，

20、洗去杂质，倒弃收集管液体。8. 最高速再离心 1 分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。9. 将质粒纯化柱置于 1.5 毫升离心管上，加入 50 微升溶液 V 至管柱面上，放置 1 分钟。10. 最高速离心 1 分钟，所得液体即为高纯度质粒。11. 0.8% TAE 凝胶电泳检测质粒完整性。三酶切 SOD 基因和 PET-32A 质粒的双酶切及连接SOD 基因和 PET-32A 质粒的双酶切在 EP 管中，加入如下双酶切体系名称加入体积（ ul）10× Buffer M2EcoRV 限制性切酶1HindIII 限制性切酶1SOD 基因 /PET-32A 质8粒无菌水8总体积 20u

21、l上述反应体系， 37 反应 2h。酶切产物的回收苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验四 DH5 感受态制备及转化感受态制备1.LB 培养基配制：称取 10g 胰蛋白胨， 5g 酵母提取物， 10g NaCl ，调节 pH 至 7.2 ，定容至 1L。高温高压灭菌。2.转移 0.1ml DH5 菌液于一只装有 5-8 ml LB 的试管中 . 于 37 °C 下，250rmp振荡培养 2 到 2.5 小时（检测 OD600 ，控制其在 0.4-0.5 之间）。3.室温下， 4000 rpm 离心 5 分钟收集对数期细胞。 弃培养基，保留细胞沉淀。4.加入 5 毫升冰冷

22、的 CaCl2 溶液，并轻微打匀。5.4°C 下， 4000 rpm 离心 10 分钟收集细胞。6.加入 0.5ml ( 每 25 ml 初始培养物加入 1ml) 冰冷的 0.1M 的 CaCl2 溶液，并轻微打匀。冰浴放置 20min 。7.此时的感受态细胞可直接进行转化操作， 也可以分装 ,加入 1/10 体积的 30%甘油后于 -70 °C冰冻保藏。转化8. 向事先灭菌，并经冷处理的 1.5ml EP 管中转移 100ul 感受态细胞悬浮液。 向每个转化管中加入 10ul 连接产物。细心混匀管中成份。于冰浴放置30 到 40 分钟。9. 把转化管转移至放于 42

23、76;C 循环水浴锅中预热的试管架上， 准确计时 90 秒。（此时不能摇动转化管）10. 把 EP 管迅速转移至冰浴 2 到 3 分钟。 随后向每个 EP 管中加入 500ul LB 培养基。 37°C 200rmp 摇菌 45min ，以使细菌复原，并容质粒所编码的抗生素抗性的表达。11. 上述反应物 4000rmp 离心 2min ，吸弃部分培养基，使剩余体积不超过200ul ，吹打混匀，随后涂布于含有 amp的 LB-琼脂平板上。12. 37放置平板直到其上液体被吸收。13. 于 37°C 倒置平板培养。转化克隆应该于12-16 小时区间出现。14. 挑取单菌落，置于

24、 6 ml 含有 amp 的 LB 液体培养基中， 37 250rmp 摇菌培养 8h。五 SDS-PAGE 检测 SOD 蛋白的表达1.取 4 ml 转化成功的菌液，加入1 ml 蛋白上样缓冲液， 100 裂解 10min 。2.4， 12000rmp离心 5min ，收集上清。3.将玻璃板、样品梳冲洗干净，晾干，随后组装玻璃板。4.按如下体积配制 10%分离胶 8 ml ，混匀：5.向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层双蒸水，大约30min 后胶即可聚合。苏州科技学院生物实验中心学生实验报告生物工程综合实验6.按如下体积配制 4%浓缩胶 3.0ml ，混匀：7.将上层双蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳。8.装好电泳系统，加入点击缓