疾控中心检验科沙眼衣原体核酸扩增荧光检测

1、疾控中心检验科沙眼衣原体核酸扩增荧光检测1. 目的：保证CT DNA检测结果准确、可靠。2. 适用范围：CT DNA的 TaqMan荧光定量检测，标本类型为分泌物。3 负责人： 操作人：4. 原理： 本试剂盒用一对沙眼衣原体特异引物和一条沙眼衣原体特异性荧光探针，PCR反应液，耐热DNA聚合酶（Taq酶），四种核苷酸 单体（dNTPS等成分，再用 PCR体外扩增法检测沙眼衣原体 DNA5. 性能参数：检出低值v 25基因拷贝/ml。6. 标本要求：（ 1 ）标本类型： 分泌物。（ 2）标本采集： 见标本采集手册。（3）标本储存和运输：室温放置不超过 8小时，4-8 C不超过72 小时，-20

2、C保存期6个月，应避免反复冻融。室温运输。（ 4）标本拒收状态： 细菌污染标本不能作测定。7. 容器和添加剂类型： 无菌离心管和无菌试管。8. 所需设备： ABI GeneAmp 5700、台式高速离心机、混匀器、冰箱（4C、-20 C）、生物安全柜、紫外灯9. 试剂：DNA提取液（500卩1/管）2管；CT-PCR反应液（未贴标签管）20管；阳性定量质控标准品（1 X 108基因拷贝/ml ） （50卩1/ 管）1管；阴性质控品（250卩1/管）1管。10. 校准程序（计量学溯源性）：送XXX市计量检测所校准。11 程序步骤 :：11.1 标本采集、保存和运送男性：取尿道分泌物或细小棉拭子伸

3、入快尿道约24cm略捻拭子取出分泌物（应略带黏膜） 。将分泌物或棉拭子置入无菌玻璃管，用无 菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。女性：阴道用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌 棉拭子插入宫颈内，停 5 秒钟后旋动棉拭采取宫颈分泌物，将棉拭子置 入无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。尿道用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2cm,略捻拭子取出分泌物（应略带黏膜）。将棉拭子置入无菌玻璃 管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。标本可立即用于测试，也可保存于-20 C待测，保存期为6个月。标本运送应采用 0 C冰壶。11.2 标本及对照标准品的处理标本试管中加入 1ml

4、无菌生理盐水,充分震荡摇匀,吸取液体转至 1.5ml 离心管中 （如分泌物较多, 只取 0.2ml ） 12000rpm 离心 5 分钟 .沉淀加无菌生理盐水1ml打匀，12000rpm离心5分钟,再重复洗涤一次沉淀直接加50ulDNA提取液充分混匀，（提取液内含不溶于水的物质,取 样时需用加样器充分混匀后吸取。 如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取 样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。 ） 沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），转至4C静置6-8小时以保证充 分裂解。12, OOOrpm离心2分钟，取上清液2ul做PCR反应。另取阴阳 性质控标准品各50ul加等量DNA提

5、取液打匀，沸水浴10分钟后同上处 理。11.3GeneAmp5700操作取单管单人份 PCR反应管若干管，直接加入处理后样品（或阴阳性质控标准品）2ul , 6000rpm离心数秒。将各反应管放入 PCR仪，按下 列条件扩增：ABI GeneAmp570（的循环条件：93C 2分钟预变性，然后按 93C 45秒55 C 60秒，先做10个循环，最后93 C 30秒55 C 45秒，做30 个循环。所有设置全部完成后保存文件，最后运行程序。11.4 结果分析条件的设定ABI GeneAmp5700的条件设置：反应结束后保存检测数据文件。根 据分析后图像调节 baseline 的 start 值

6、（24）,stop 值（79） 以及 Threshold 值, 使阴性质控品 Ct 值为 30, 临界阳性质控标准品 Ct 值为 2224,强阳性质控标准品 Ct值为1820,最后记录仪器自动分析计算出 的 Ct 值.12 质量控制程序：阴性质控品：全部阴性 阳性定量标准品：全部阳性I r | 三 0.97（correlation 数值介于-0.97-1）; 108 至 104 基因拷贝/ml的阳性标准品检测的定量值与理论值相比误差小于土300%13 干扰： 标本污染。14 生物参考区间： 正常人样本为阴性或 0 基因拷贝 /ml 。15. 患者检验结果的可报告区间：Ct值40,实验样本的CT DNA含量（基因拷贝数/ml ） =M Ct值=40,样品CT DNA含量25基因拷贝