乳牙牙髓干细胞库的构建

1、乳牙牙髓干细胞库的构建干细胞是一类具有自我更新、高度增殖与多向分化的细胞。根据干细胞所处的发育阶段，干细胞库分为胚胎干细胞库和成体干细胞库2种。进行胚胎干细胞研究必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式，因此，胚胎干细胞的研究一直颇具争议遭到一部分人的反对。成体干细胞已从成年个体不同组织中成功分离，该细胞通过分裂维持自身细胞群大小，经诱导后又可进一步分化为各种不同的组织细胞，继而构成机体中各种组织器官。作为种子细胞，干细胞可以修复和重建受伤或病变的多种组织器官，因此，干细胞库/细胞银行的设想为干细胞能及时对病变部位和外伤受损处的再生性治疗提供了新思路。如何以最简单、无创的途径获取种子

2、细胞已成为学者们关注的焦点。目前，已有研究探讨应用成人牙髓干细胞取代骨髓基质干细胞治疗因脊髓损伤而导致瘫痪的患者。在儿童脱落的乳牙中，含有丰富的乳牙牙髓干细胞(stemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth，SHED)。最近的研究表明：SHED也具有多向分化的能力，相对于从个体阻生第三磨牙或因正畸拔除的前磨牙中获取干细胞的途径来说，脱落乳牙是一个更容易获得干细胞的途径。国外已有学者对SHED库进行了研究，并由此产生了多家机构建立SHED库。美国BioEden公司在创立“乳牙银行”(BabyToothCellBank)并在英国(面向欧洲)和泰国(面向东南亚)

3、建立了国际实验室，以构建SHED储存库。日本广岛大学于2005年建立了“ThreeBrackets研究所，这是日本第一家牙齿银行(”ToothBank)，并于2008年与台北医学大学实验室合作建立第一家DPSC库，其中就包括SHED；随后，在2007年，名古屋大学也建立起类似的实验室。在北欧挪威，Norwegian牙齿银行已经收集超过10万颗乳牙样本，并且建立起宣教的机构以普及干细胞储存意识。1 建立SHED库的设想1.1 SHED的生物学特性SHED与其他组织来源的干细胞在生物学特性上有很多相似之处。Gronthos等对牙髓干细胞(dentalpulpstemcell，DPSC)的克隆形成率

4、进行了研究，与骨髓基质干细胞(bonemarrowstromalcell，BMSC)比较后发现：SHED中DPSC的克隆形成率明显高于骨髓来源的BMSC，这就表明DPSC具有较BMSC更高的增生能力和自我更新能力。Miura等发现：从1颗脱落前牙取材的每1220个细胞就可以形成黏附克隆集落，这是间质干细胞增殖的典型表现。进一步的实验结果表明：与BMSC和DPSC相比较，SHED有更高的增殖能力。DPSC在不同诱导剂的作用下，可分化为成牙本质细胞、脂肪细胞、软骨细胞和神经样细胞等多种细胞。研究人员主要集中研究SHED的体外成骨的潜能，如Cordeiro等利用SHED与生物可降解支架与人牙齿切片复

5、合移植于免疫缺陷小鼠，1428d后将移植物进行免疫组织化学的检查，结果发现牙本质涎蛋白表达阳性，推断SHED在体能分化为成牙本质样细胞。在成脂、成软骨和成神经诱导方面均有研究证实SHED具有多向分化的潜能，为其在体植入SHED使受损或衰退的组织、器官改善或恢复功能提供了理论依据。1.2 SHED细胞库的优点从伦理道德学角度考虑：胚胎干细胞的研究对胚胎的破坏作用使其颇具争议，遭到一部分人的反对，而SHED是成体干细胞，不受伦理学的限制。取材方面：从个体脱落的乳牙获取SHED较为简单可行，且对供体（儿童）伤害最少，其父母也较易接受；个体化获取和保存SHED来进行自体移植再生性治疗，能最大限度地降低

6、免疫排斥和疾病交叉感染的风险；此外，先于病变发生而储存干细胞，为个人提供了终身保障，这也是建立干细胞库的指导思想之一；SHED库更可用于供体近亲，如祖父母、父母和兄弟姐妹等。Arora等的研究表明：SHED库的储存费用仅仅为脐带血细胞库的1/3。在多向分化能力和临床应用潜能方面，SHED等成体干细胞与脐带血来源的干细胞互为补充，脐带血干细胞能提供血液中的主要细胞如红细胞、白细胞和血小板，用于治疗多种血液疾病，而SHED则可在软硬组织再生方面起作用，这是造血干细胞无法比拟的。2建立SHED库的技术要点医患双方经过充分沟通并了解双方的权利和义务后，签署“干细胞自体储存协议书”并交付一定的费用，收集

7、供体脱落的乳牙，从乳牙牙髓中培养分离SHED存入自体储存库，干细胞所有权归存储者所有，其所存的干细胞只用于拥有者本人或经拥有者同意转让给其他家庭成员和无关第三人。建立SHED库要经历乳牙收集、SHED的分离和储存3个步骤。2.1乳牙的收集在收集乳牙前应首先对该乳牙的牙体和牙髓状况进行判断，选择无龋和无牙髓炎症的乳牙，这是成功获取SHED的前提。因此，Arora等制定了建立SHED库收集乳牙的标准：1 ）新鲜拔除的乳牙由口腔医生判断牙体和牙髓的状况，筛选无龋、无牙髓炎症和牙髓坏死等症状的乳牙；2 ）选取至少剩余1/3牙根的乳切牙或乳尖牙，不推荐选用乳磨牙作为样本；3）由于正畸治疗的需要提前拔除的

8、健康乳磨牙也可纳入收集标准。将所收集的乳牙置于含无菌低渗磷酸盐缓冲液（phos-phatebufferedsaline，PBS）的转移管中，低温保存转移至实验室，并对供体资料逐一进行记录。干细胞存活能力与收集处理时间和保存温度密切相关，这成为干细胞库建立的障碍之一。因此，Arora等建议：从收集乳牙到处理牙髓的时间不应超过40h。Honda等提出：长时间冻存组织会影响端粒酶活性，导致细胞衰老。但也有学者持不同意见。Perry等对处理时间进行了研究后发现：将收集到的健康牙齿低温保存120h后，仍能从牙髓中分离出相当数量的干细胞；Oh等对即时处理组与低温冻存后处理组获得的牙周膜细胞活性进行分析，结

9、果发现2组间差异无统计学意义，均提示可放宽从收集牙齿到处理牙髓的时间限制。2.2 SHED的培养、分离和鉴定参考Miura等的方法：从预冷的培养液中取出牙齿，以聚维酮碘消毒牙面；用含有双抗的0.01molL-1的PBS反复冲洗，劈开牙冠或牙科裂钻钻开牙冠，取出冠根部牙髓，PBS反复冲洗；用眼科弯剪将牙髓组织剪成小块，加入3gL-1的I型胶原酶和4mgL-1的中性蛋白酶，37下消化1h，期间多次振荡，最终未见成形的牙髓组织；离心弃上清液及洗净胶原酶后，沉淀用培养液充分混匀，反复吹打离散细胞团块，通过孔径70m的细胞筛网过滤，以获得单细胞悬浮液；细胞计数按每毫升有1M05个细胞的密度接种到，透气的

10、培养瓶中，加入含有质量分数为20%的胎牛血清和质量分数为1%的青-链霉素溶液的改良Eagle培养基(DulbeccosmodificationofEaglesmediumdulbec，coDMEM)培养液；置于37、体积分数为5%的CO2孵育箱中培养，3d后半量更换培养液，弃去未贴壁细胞；每23d完全更换培养液1次，细胞汇合达70%80%时，质量分数为0.25%的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸室温消化，离心弃上清液，沉淀按1：3比例传代；有限稀释法分离纯化SHED。为鉴定培养分离的细胞具有干细胞特性，挑选具有克隆形成能力的细胞，流式细胞术检测BMSC和DPSC共同表达的细胞表面标记物如Stro-1，C

11、D44，CD146，对于表达阳性的细胞群，再进行体外多向分化诱导，进一步从功能上验证所培养的SHED具有多向分化潜能。最后，将所分离出的SHED的健康和活性证明给予供者父母，履行知情权。2.3 SHED的冻存细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，使细胞暂时脱离生长状态而使其细胞特性得以保存，需要时再复细胞。细胞冻存时，向培养基中加入保护剂二甲基亚砜，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。Papaccio等将筛选、扩增培养出的DPSC冻存于液氮，储存2年后复，发现冻存后的干细胞增殖率、凋亡率和多向分化能力与新鲜培养DPSC的差别无统计学意义。对于干细

12、胞冻存的温度，多数学者倾向于将其保存于液氮，以最大限度保存干细胞的活性。但也有学者持相反意见，如Woods等将DPSC分组分别保存于-85冰箱和-196液氮中6个月，复后发现：2组冻存细胞的增殖率并无统计学差异。最近，日本学者对冻存方法提出了新的设想-磁冻结(magneticfreezing)，其原理是即使应用一个较弱的磁场，都能使其中的介质冰点降低67，以确保所保存的物质能在其结冰点以下却不结冰，可以避免因结冰膨胀而导致的细胞壁受损。利用此技术对比在几种冻存方式下细胞存活率后发现：磁冻结后的细胞存活率达83%，液氮保存则只有63%，-85冰箱保存的为45%，而家庭用冰箱(-20)却只有低至21.5%的存活率。但目前此技术尚未普及。综上所述，建议SHED库的冻存：(1)将样本干细胞分为4份分别冻存于液氮中，以确保干细胞不会因出现问题而全部遭弃；(2)以每1.5mL的细胞冻存液含有1.02.0106个细胞为宜，密度太高或太低均会导致细胞复率的下降；(3)细胞冻存时应以1Cmin-1的降温速度降温至-85C,随后即可库存于液氮中。3 结束语SHED库有不受伦理学的限制、取材简便可行、对供体(儿童)伤害最少、自体移植能最大限度地降低免疫排斥和疾病交叉感染的风险以及能在供者本人甚至直系亲属有需要时迅速提供种子