酶循环法及其在酶法分析中的应

1、酶循环法及其在酶法分析中的应用杨昌国，许叶(宁波市医学科学研究所，浙江宁波315010)关键词：酶法分析；酶循环法中图分类号： R461.1 文献标识码： A 由于酶法测定的特异性好，检测简便，反应温和，无污染，且灵敏度较高(10 100umol/L) ，已能满足体液中大部分物质的测定，因此在临床化学测定中已广为应用。随着临床化学的发展，体液中某些微量物质 的准确测定逐渐显得重要。酶循环法是利用酶的底物特异性来放大靶物质(被测物)的测定方法。此法仅 循环靶物质，减少了样品中存在的其它物质对测定的干扰，因此不需要对样品进行预处理或队靶物质的提 取，而且该法不需要专门的设备，是一种前景广阔的测定技

2、术。日本旭化成( Asahi Chemical )公司发展 了这一技术，笔者参考旭化成公司的有关资料，将这一技术介绍给国内的同行。1 酶循环法的原理物质A在酶a和底物 a(Sa)的存在下转化为物质 B，同时生成产物 a(Pa) ；这物质 B又在酶 b(Eb)和底物 b(Sb) 的存在下转化为物质 A，同时生成产物 b(Pb) 。上述反应每循环一次，将消耗与物质A等量的 Sa和 Sb，同时生成等当量的 Pa和 Pb。因此在一定时间内，循环反应的次数亦就是Sa和 Sb消耗或 Pa和 Pb生成相当于物质 A(或物质 B)的倍数，通过检测 Sa或 Sb 的减少或 Pa或 Pb的生成就可以提供检测物质

3、A(或物质 B) 的 n 倍灵敏度。见图 1 。底物 a(Sa) 产物 a(Pa)产物 b(Pb) 底物 b(Sb)图1 酶循环法原理1.1 条件Sa1.1.1 物质 A和B的浓度与酶 a和酶 b对底物 Sa和Sb的Km值相比较，应相当小，即 A或B KmSa(或 KmSa) 。1.1.2 酶 a和酶 b对底物 Sa和 Sb的 Km值应相当小，对底物应有高亲和力。1.2 原理 米氏方程 v V?S/( S+Km) ，vK?S ，(KV/Km)。当 t 0、A=A 0 、B=0 时，A B A0 ；当t 0并假设反应已达到平衡状态，那么， Ea的速度是 VbKbA 。Eb的速度是 VbKbB 。

4、 在平衡状态时， vavb 因此，A:B=Kb:Ka 。循环反应速度 vc va vb( 固定的 )，假设 vc KcA 0(Kc= 循环速率常数 )，那么从 KcKa?Kb/(Ka+Kb) 推导，如果 Ka+Kb常数，当 KaKb时， Kc 是最大的。t1.3 测定灵敏度 Pa Pb Vcdt Kc A0 t0 。02 酶循环反应的灵敏度 可通过产物的循环常数 (Kc) 和反应时间 (t) 来确定； Kc 又可通过两种酶的量来确定；酶量又取决于酶 的特异活性和 Km值，循环反应是在相同的条件 (如温度、离子强度等 )下进行， 两种酶的反应常数亦相 同( 由于 Va/Kma=Vb/Kmb，因此

5、 Kc Ka Kb)。既然循环反应的灵敏度可通过Kc× t(min) 来确定，故可用调整加入酶量或反应时间来随意控制。选择Km小的酶，用较小的酶就能得到较高的灵敏度。3 循环反应的类型按反应中使用的酶可分四种类型：3.1 方法 A 底物循环，氧化酶和脱氢酶系统。氧化酶对靶物质氧化，脱氢酶又把氧化态的靶物质转化成 还原态。靶物质和它的氧化产物作为底物被循环，速率可达50 300 次/ 分。举例：溶血卵磷脂（lysolrcithin）（ 又称溶血磷脂酰胆碱， lysophosphatidyl choline） ，是磷脂的一种， 它随氧化型 LDL 和 VLDL 水平增高而增高，后两者已确

6、认与动脉粥样硬化的发生和发展有关。测定原理见图2。预处理反应：甘油 O2 GO H 2O2甘油醛测定反应：(1) 溶血卵磷脂 LYPL(2) GPC H 2O GP(3)O2 H2O2GPC脂肪酸G3P胆碱DAOS4-AAPDAOS（比色测定）G3PD循HA环PGO：甘油氧化酶LYPLGPC：甘油磷脂酰胆碱GPCPG3P： 3磷酸甘油GPODHAP：磷酸二羟丙酮G3PDH12-HSD：12- 羟类固醇脱氢酶DAOS胺图 2 溶血卵磷脂酶循环法原理：溶血磷脂酶：磷酸二酯酶：甘油磷酸氧化酶：3磷酸甘油脱氢酶：N-乙基-N-（2- 羟基-3- 磺丙基 ）-3,5- 二甲氧苯NAD NADH12 -H

7、SD胆碱酮类胆酸3.2 方法 B 底物循环，脱氢酶和辅酶系统。靶物质和它的氧化产物作为底物被循环，仅用一种酶和两种辅 酶（巯基 NAD和 NADH。） 在 410nm测定巯基 NADH的增高速率，循环速率约 100 次/分。举例：胆汁酸测 定，原理见图 3。巯基 -NAD巯基 -NADH（415nm测定 ）胆汁酸 循环 酮类胆汁酸-HSDNAD NADH3-HSD：3- 羟类固醇脱氢酶图3 胆汁酸酶循环法测定原理3.3 方法 C 辅酶循环，双脱氢酶系统。靶物质被转化为辅酶 本系统灵敏度很高，循环速率至少可达NH3（NAD），使用两种脱氢酶使 NAD-NADH间循环。1000次/ 分。举例： N

8、H3测定，原理见图 4。D-葡萄糖 脱氢酶D- 葡萄糖酸 - - 内酯 图 4 NH3三磷酸腺苷脱氨 -NAD葡萄糖NAD黄递酶循环四唑盐单磷酸腺苷 PPi 甲月簪染料 （ 比色测定 ）酶循环法测定原理 利用这一反应原理，增加前反应亦可测定尿素和肌酐。 尿素前反应：Urea H 2O2NH 3 CO2肌酐前反应：肌酐 H 2O 肌酐脱氨基酶 N 甲基乙丙酰脲 NH3.4 方法 D 氨循环， NAD合成酶 - 脱氢酶系统。靶物质 NH3被转化成 NAD，再通过亮氨酸脱氢酶使 L-亮氨 酸转变成氧化异己酸和 NH4+， NH4+又重复反应，原理见图 5。NH4 酶循环法的特征和应用前景 传统的酶反

9、应只能按靶物质的量生成相应的产物量，而酶循环法则可在一定的反应时间内通过靶物 质的重复反应来增加产物的量。 因此， 可通过延长反应时间和 / 或增加酶的用量来加速循环以增加循环 次数 （循环速率 ） 来提高灵敏度。 选择用高循环速率的酶和合适的循环方法可使循环速率达到501000次/ 分。另外通过使用酶的特殊底物 （ 如巯基 -NAD）可简化反应体系，亦可偶联呈色反应 （ 如四氮唑染料 或 Trinder 反应 ） 使其成为可见光谱测定。 本法还可与荧光和发光分析结合使灵敏度更高。 由于本法是 一个比色测定，它可能被用作 EIA 检测方法，消除测定污染的存在。5 酶循环法推广应用尚需克服的难题由于酶循环法具有诸多优越性，是一种有前途的测定方法，但目前要推广使用尚有一些问题需要解 决：因此法工具酶的用量是普通酶法的