基于壳聚糖载体的蛋白质药物纳米

1、基于壳聚糖载体的蛋白质药物基于壳聚糖载体的蛋白质药物纳米颗粒制备研究纳米颗粒制备研究070804227 070804227 张霞张霞 近几年来近几年来, , 随着纳米技术的飞速发展随着纳米技术的飞速发展, ,将纳米颗粒的制备技术引入壳聚糖将纳米颗粒的制备技术引入壳聚糖- -蛋白蛋白质药物载体的应用领域逐渐成为人们的质药物载体的应用领域逐渐成为人们的研究热点研究热点. . 壳聚糖壳聚糖( chitosan)( chitosan)是甲壳素脱乙酰化的产是甲壳素脱乙酰化的产物物, ,是地球上仅次于纤维素的最为丰富的是地球上仅次于纤维素的最为丰富的天然高分子化合物天然高分子化合物, , 其化学名称为聚其

2、化学名称为聚 2-2-氨基氨基- - 2-2-脱氧脱氧- - - 葡萄糖葡萄糖, ,是由是由N -N -乙酰乙酰氨基葡萄糖以氨基葡萄糖以 -1, 4-1, 4糖苷键缩合而成糖苷键缩合而成, , 是是一种天然聚阳离子碱性多糖一种天然聚阳离子碱性多糖. . 壳聚糖是一种用途很广的天然高分子化壳聚糖是一种用途很广的天然高分子化合物合物, , 具有无毒、具有无毒、 生物相容性、生物相容性、 吸附功吸附功能、能、 生物可降解性及多种生物学活性等生物可降解性及多种生物学活性等优异性能优异性能. .本文思路：本文思路： 采用基于壳聚糖采用基于壳聚糖(CS)(CS)与聚阴离子与聚阴离子( (多聚磷酸纳多聚磷酸

3、纳) )间静电作间静电作用的离子凝胶化方法用的离子凝胶化方法, ,以牛血清白蛋白以牛血清白蛋白(BSA)(BSA)为模型为模型, ,在在室温下制备了包载蛋白质的亲水性壳聚糖纳米颗粒室温下制备了包载蛋白质的亲水性壳聚糖纳米颗粒. .对对BSA-BSA-壳聚糖纳米颗粒的形成条件进行了考察壳聚糖纳米颗粒的形成条件进行了考察, ,结果表结果表明明: :在在pH pH 值为值为5. 0, CS 5. 0, CS 与与TPPTPP的质量比为的质量比为4, 4,壳聚糖分子壳聚糖分子量为量为400kDa400kDa的最优化的条件下可制备粒径小于的最优化的条件下可制备粒径小于100 nm100 nm的的BSA-

4、BSA-壳聚糖纳米颗粒壳聚糖纳米颗粒, ,对对BSABSA的包封率达到的包封率达到50%50%以上以上. .并将该体系初步应用于蛋白类药物丙种球蛋白并将该体系初步应用于蛋白类药物丙种球蛋白- -壳聚糖壳聚糖纳米颗粒的制备研究纳米颗粒的制备研究, , 这种壳聚糖纳米颗粒对丙种球蛋这种壳聚糖纳米颗粒对丙种球蛋白具有良好的缓释作用白具有良好的缓释作用. .1 1、实验部分、实验部分1.1 1.1 试剂及仪器试剂及仪器壳聚糖壳聚糖, Fluka , Fluka 公司公司; ; BCA BCA 蛋白质试剂盒蛋白质试剂盒, , 美国美国PiercePierce公司公司; ; 牛血清白蛋白牛血清白蛋白, ,

5、 上海伯奥科技有限公司上海伯奥科技有限公司; ;丙种球蛋白丙种球蛋白, , 南京军区生物制品药物研究所南京军区生物制品药物研究所; ;其他试剂均为国产分析纯其他试剂均为国产分析纯. .SPA-400 SPA-400 原子力显微镜原子力显微镜, , 日本精工公司日本精工公司; ;3000HS 3000HS 激光粒度分析仪激光粒度分析仪, , 英国英国 Malvern Malvern 公公司司; ;CR22G CR22G 高速冷冻离心机高速冷冻离心机, ,日本日立公司日本日立公司. .1.2 1.2 实验方法实验方法1.2.1 BSA1.2.1 BSA壳聚糖纳米颗粒的制备及影响壳聚糖纳米颗粒的制备

6、及影响 因素的考察因素的考察 先将壳聚糖溶解到先将壳聚糖溶解到HAC-NaACHAC-NaAC缓冲缓冲溶液中溶液中, ,在磁力搅拌下在磁力搅拌下, ,将一定体积溶有将一定体积溶有BSA BSA 的的TPP TPP 溶液滴加到壳聚糖溶液中溶液滴加到壳聚糖溶液中, ,室温下反应室温下反应3 h 3 h 后即可后即可. . 改变缓冲溶液的改变缓冲溶液的pHpH值、值、 CS CS 及及TPPTPP的质的质量比量比以及以及选用不同分子量的壳聚糖选用不同分子量的壳聚糖制备制备BSA-BSA-壳聚糖纳米颗粒壳聚糖纳米颗粒( CS-BSA-TPP) ,( CS-BSA-TPP) ,在激光粒度分析仪上测定不同

7、条件下颗在激光粒度分析仪上测定不同条件下颗粒的平均粒径粒的平均粒径, ,分别考察上述条件对纳米分别考察上述条件对纳米颗粒粒径的影响颗粒粒径的影响. .1.2.2 BSA-1.2.2 BSA-壳聚糖纳米颗粒的表征壳聚糖纳米颗粒的表征 根据粒径的最佳条件制备根据粒径的最佳条件制备CS-BSA-T PP CS-BSA-T PP 纳米颗粒纳米颗粒, ,取适量产品溶液滴于云母片上取适量产品溶液滴于云母片上, , 自然干燥后通过原子力显微镜观测纳米颗自然干燥后通过原子力显微镜观测纳米颗 粒的直观形貌图粒的直观形貌图. .1.2.3 BSA 1.2.3 BSA 包封率的测定包封率的测定 按上述最佳条件制备按

8、上述最佳条件制备CS-BSA-T PP CS-BSA-T PP 纳纳米颗粒及未包载米颗粒及未包载 BSA BSA 的空白纳米颗粒的空白纳米颗粒( ( CS-TPP) , CS-TPP) , 取适量产品溶液在取适量产品溶液在1010下超下超速离心速离心( 26 000 r/ min) 30 min,( 26 000 r/ min) 30 min,量取适量量取适量上清液上清液, ,按照按照BCA BCA 蛋白质试剂盒提供的蛋白质试剂盒提供的方法绘制标准曲线方法绘制标准曲线. . 测定上清液中测定上清液中 BSA BSA 的浓度的浓度, ,根据下列公根据下列公式求出式求出BSA BSA 的包封率的包

9、封率: : A . E. %= ( m - m1) / m 100%.A . E. %= ( m - m1) / m 100%. 式中式中: m : m 为为BSA BSA 总量总量; m1 ; m1 为上清液中为上清液中BSA BSA 的含量的含量. .2 2、结果与讨论、结果与讨论2.1 CS2.1 CS与与TPP TPP 质量比对颗粒粒径的影响质量比对颗粒粒径的影响 改变改变CS CS 与与TPP TPP 的质量比的质量比( (mcs/mTPP) , ) ,分别分别测定不同条件下测定不同条件下 CS-BSA-TPP CS-BSA-TPP 纳米颗纳米颗粒的粒径粒的粒径, , 当当mcs/m

10、TPP值在值在3 8 3 8 之间时之间时, , 颗粒的平均粒径处于颗粒的平均粒径处于80 250 nm80 250 nm之间之间, , 其其中以中以 mcs/mTPP为为 4 4：1 1时粒径最小时粒径最小; ; 而而mcs/mTPP值低于值低于 3 3 及高于及高于 10 10 以后以后, , 得到的得到的是微米颗粒是微米颗粒. .当当 pH pH 值大于值大于 4 4 之后其粒径迅之后其粒径迅速减小速减小. .当当pH pH 值值为为 5. 0 5. 0 时时, CS-, CS-BSA-TPP BSA-TPP 纳米纳米颗粒的粒径最颗粒的粒径最小小. .2.2 pH 2.2 pH 值对颗粒

11、粒径的影响值对颗粒粒径的影响 原因：原因：由于由于CS CS 表面带正电荷表面带正电荷, , 而而TPP TPP 是是带负电荷的多聚阴离子带负电荷的多聚阴离子, , 二者基于静电作二者基于静电作用形成球珠状凝胶用形成球珠状凝胶, BSA , BSA 可被包裹进其交可被包裹进其交联网络骨架内联网络骨架内. .当当pH pH 值接近或超过值接近或超过BSA BSA 的等点电时的等点电时, TPP , TPP 及及BSA BSA 表面所带负电表面所带负电荷较多荷较多, , 更易于与带正电荷的更易于与带正电荷的CS CS 交联交联, ,因因而形成的纳米颗粒很紧密而形成的纳米颗粒很紧密, , 粒径很小粒

12、径很小. . 由此可见由此可见, , 在在pH pH 值为值为5. 0 5. 0 的的HAC-HAC-NaAC NaAC 缓冲溶液中制备的壳聚糖纳缓冲溶液中制备的壳聚糖纳米颗粒平均粒径最小米颗粒平均粒径最小, ,稳定性好稳定性好. .固定固定pH pH 值为值为5. 5. 0, CS 0, CS 与与TPP TPP 的质量比为的质量比为4 4：1, 1,制备制备3 3 种分种分子量的子量的 CS-CS-BSA-TPP BSA-TPP 纳纳米颗粒米颗粒. . 最最小小2.3 2.3 壳聚糖分子量对颗粒粒径的影响壳聚糖分子量对颗粒粒径的影响 结果见图结果见图3, 3,分子量分别为分子量分别为 30

13、0 kDa 300 kDa 及及 400 400 kDakDa时时, ,颗粒的粒径小于颗粒的粒径小于200 nm, 200 nm, 而分子量而分子量为为 400 kDa400 kDa时最小时最小. . 当壳聚糖分子量增大当壳聚糖分子量增大为为600 kDa600 kDa时时, ,产生的颗粒尺寸大于产生的颗粒尺寸大于500 500 nm.nm.进一步比较了进一步比较了3 3 种壳聚糖纳米颗粒所种壳聚糖纳米颗粒所包载包载BSA BSA 的包封率的包封率, , 发现发现2 2 种大分子量的种大分子量的壳聚糖包封率均比较高壳聚糖包封率均比较高. .原因：原因：壳聚糖自身具备高聚物的结构特征壳聚糖自身具

14、备高聚物的结构特征, ,分子量越大其聚合度越大分子量越大其聚合度越大, ,越有利于与聚越有利于与聚阴离子形成聚合物阴离子形成聚合物交联网络交联网络, , 能被这种聚能被这种聚合物交联网络包裹进去的合物交联网络包裹进去的 BSA BSA 的量也越的量也越多多. . 因此因此, , 综合考虑包封率和颗粒大小综合考虑包封率和颗粒大小, , 我们选择分子量为我们选择分子量为 400 400 kDakDa的壳聚糖的壳聚糖作为药物的合适载体作为药物的合适载体. .2.4 BSA-2.4 BSA-壳聚糖纳米颗粒的表征壳聚糖纳米颗粒的表征 如图如图 4 4 所示所示, BSA-, BSA-壳聚糖纳米颗粒呈壳聚

15、糖纳米颗粒呈球球形形, , 粒径分布在粒径分布在 50 100 nm 50 100 nm 之间之间. . 同时利同时利用激光粒度分析仪对纳米颗粒的粒径进用激光粒度分析仪对纳米颗粒的粒径进行动力学统计行动力学统计, , 根据粒径的数量分布显示根据粒径的数量分布显示, , 99. 4%99. 4%的纳米颗粒的粒径为的纳米颗粒的粒径为( 67. 0 ( 67. 0 24. 24. 3) nm, 3) nm, 与原子力显微镜的观测结果基本与原子力显微镜的观测结果基本吻合吻合. .2.5 2.5 壳聚糖纳米颗粒在丙种球蛋白纳壳聚糖纳米颗粒在丙种球蛋白纳米药物载体制备中的初步应用米药物载体制备中的初步应用

16、 固定固定 CS CS 与与 TPP TPP 的质量比为的质量比为 4:1, 4:1, 在在 pH pH 值为值为5. 0 5. 0 的条件下的条件下, ,选择分子量为选择分子量为 400 kDa400 kDa的壳聚糖的壳聚糖, , 制备包载丙种球蛋白的壳聚糖制备包载丙种球蛋白的壳聚糖纳米颗粒纳米颗粒. .结果表明结果表明: : 制备的纳米颗粒平制备的纳米颗粒平均粒径在均粒径在50 100 nm 50 100 nm 之间之间, , 包封率为包封率为55. 55. 0% .0% . 同时同时, , 为进一步考察该纳米颗粒能否实现为进一步考察该纳米颗粒能否实现丙种球蛋白的释放丙种球蛋白的释放, ,

17、初步探讨了其在初步探讨了其在PBS PBS 中的体外释放特征中的体外释放特征, ,结果如图结果如图5 5 所示所示. .在释药初期在释药初期( 1 2d ( 1 2d 内内) , ) ,大约释放大约释放20%20%的丙种的丙种球蛋白球蛋白, , 在在随后几天内随后几天内, ,释放度一直释放度一直趋于平缓趋于平缓, , 到第到第 10 10 天天释放度达到释放度达到52. 5% .52. 5% . 结果显示结果显示, ,该壳聚糖纳米颗粒对丙种该壳聚糖纳米颗粒对丙种球蛋白具有良好的缓释作用球蛋白具有良好的缓释作用. .3 、结 论 本法不但实验条件温和本法不但实验条件温和, , 不需要有机不需要有机溶剂及戊二醛等交联剂溶剂及戊二醛等交联剂, ,可在常规实可在常规实验室大量制备大小均匀、分散性好验室大量制备大小均匀、分散性好、 性质稳定的包载蛋白质药物的