芹菜叶中提取黄酮类化合物

1、安徽工程大学引言芹菜(Apium graveolens L. )是一种草本植物，二年生、伞形科芹菜属，自然资源丰富。芹菜叶作为芹菜原料的边角料通常没有得到充分的利用，但其中含有以芹菜素为主的黄酮类化合物，具有保护血管、增强免疫力，降压安神、降血脂、镇静健胃、抗氧化、抗衰老，增强机体免疫力等功能，以及广泛的生物活性和重要的药用价值。作为天然抗氧化剂，黄酮类化合物一直备受人们的关注，因此研究提取和测定芹菜叶内的黄酮类物质，具有一定的实用价值。芹菜叶的预处理芹菜叶粉碎按1 20料液比加无水乙醚40冷凝回流2小时脱脂过滤滤渣干燥后备用。标准曲线的确定准确称取芦丁20mg(120烘至恒重),加95%乙醇

2、水溶液50 mL。准确吸取0、1、2、4、6、8、10、12mL于50mL容量瓶中,加12mL 95%的乙醇,加含5% NaNO2水溶液2mL,摇匀静置6min,再加含10% Al(NO3)3水溶液2mL,摇匀静置6min,再加含5% NaOH水溶液20mL,用95%乙醇水溶液稀释至刻度,摇匀,在490510 nm波长范围内扫描,确定最大吸收波长;在最大吸收波长(510nm)处测定吸光值。以吸收度Y为纵坐标,浓度x为横坐标,进行回归分析,绘制回归曲线。样品总黄酮得率的确定以芹菜叶为原料,经乙醇浸提总黄酮,提取液过滤离心后定容至50mL,每次准确量取1.0mL。代入回归方程(1)中计算,得出提取

3、液中总黄酮含量。总黄酮的得率%=C50/(W1000)100 单因素试验选择提取乙醇浓度、超声功率、超声提取温度、料液比、超声提取时间进行单因素试验,考察其对提取率的影响。正交试验根据单因素试验结果,选择超声功率、超声提取温度、料液比、超声提取做4因素3水平正交试验,确定最佳提取条件。正交试验因素和水平见表2-1。水平水平A超声波超声波功率功率/WB提取温提取温度度/C料液比料液比/g：mLD超声波超声波时间时间/min150501:705255601:8010360701:9015稳定性试验分别取少量芹菜叶黄酮的提取液进行日光、自然光、避光、加热时间、加热温度、pH、Vc的稳定性实验,在51

4、0 nm处测其吸光度,根据芦丁标准曲线的回归方程计算总黄酮含量,由此判断芹菜叶黄酮的光及热稳定性。芹菜叶总黄酮保存率(%)(处理后溶液中总黄酮含量/处理前溶液中总黄酮含量)100红外光谱扫描取少量芦丁粉末与少量在最佳提取条件下干燥后的粉末进行压片，进行红外扫描。确定吸光度的标准曲线0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.000 0.008 0.016 0.032 0.048 0.064 0.080 0.096 吸光度乙醇浓度对得率的影响准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0.5 g,分别加入50mL的水以及不同浓度的乙醇在60下浸提2h过滤,滤

5、液按方程(2)测定总黄酮提取率。实验结果如图3-2所示。结果表明,在较低浓度条件下,随着乙醇浓度的增加,芹菜叶总黄酮的提取率逐渐提升,到65%的乙醇为溶剂时,总黄酮的提取率达到峰值,之后,总黄酮的得率随着乙醇浓度的增加而降低。因此,选择65%乙醇为最佳溶剂浓度。乙醇浓度对得率的影响00.020.040.060.080.10.120.140.160.180.25%15%25%35%45%55%65%75%85%95%得率超声波功率对得率的影响准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5g，加入40mL65%乙醇,在60下超声功率分别为0、50W、60W、70W、80W、90W和100W时超声提取10min

6、，过滤，滤液按方程(2)测定总黄酮提取率。实验结果如图所示。结果表明随着使用超声波辅助提取,总黄酮的提取率在增加，而到50W之后，总黄酮提取率随着超声功率的增大而降低。因此50W为最佳提取功率。由于试验仪器的影响，最低的超声波提取功率只能设定在50W。超声波功率对得率的影响00.020.040.060.080.10.120.140.160.180.205060708090100得率超声波时间对得率的影响准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5g，加入40mL 65%乙醇,在60、超声功率为60W时分别超声提取5min、10min、20min、30min和40min，过滤，滤液按方程(2)测定总黄酮得

7、率。实验结果如图3-4所示。结果表明，随着时间的增加,总黄酮提取率增加,但在10min时候达到峰值，之后随着时间的增加,总黄酮提取率降低。所以选择10min为最佳的提取时间。超声波时间对得率的影响00.050.10.150.20.250.30.350.45min10min20min30min40min提取温度对得率的影响准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5 g，加入40mL 65%乙醇,分别在20、40、50、60、70和78下，超声功率为60W时超声提取10min,过滤,滤液按方程(2)测定总黄酮得率。实验结果如图3-5所示。结果表明,超声提取温度为20至60时,总黄酮得率随着温度的升高而增加

8、,而60之后随着温度的升高,总黄酮提取率降低。因此,选择60为最佳的超声提取温度。提取温度对得率的影响00.050.10.150.20.250.30.3520304050607078得率料液比对得率的影响准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5g，分别加入65%乙醇10mL、20mL、30mL、40mL和50mL，在60、超声功率为60W时超声提取10min,过滤,滤液按方程(2)测定总黄酮得率。实验结果如图3-6所示。结果表明,总黄酮提取率随料液比增大而增大,在料液比为1 80时为最大值,随后减小。料液比对得率的影响00.10.20.30.40.50.60.70.820406080100得率正交试

9、验为了全面考察超声波辅助提取的最佳工艺参数，在单因素实验的基础上,选择65%乙醇为最佳提取溶剂,以超声功率,超声提取温度,料液比和超声提取时间这4种因素进行L9(34)正交试验，确定最优方案，结果见表3-1。从表中极差数据可知,超声功率,超声提取温度,料液比和超声提取时间这4种因素对总黄酮提取率影响的主次顺序为：料液比超声波提取温度超声提取时间超声提取功率，最佳的提取条件为65%乙醇浓度，超声功率为55W，超声提取温度为50，料液比为1 80，超声提取时间为10min，最佳提取条件下所得的黄酮类化合物的得率为0.221%。正交试验试验号试验号ABCD黄酮得率黄酮得率/%111110.19321

10、2220.18831 3330.148421230.199522310.148623120.193731320.181832130.134933210.208K10.5290.5730.5220.549K20.5410.4710.5950.563K30.5240.5500.4780.482k10.1760.1910.1740.183k20.1800.1570.1980.187k30.1740.1830.1590.161极差R0.0050.0340.0390.027因素主 次料液比提取温度超声波提取时间超声波功率最优方案55W5080min10min光照对芹菜叶黄酮稳定性的影响光照对芹菜叶黄酮稳

11、定性的影响分别准确称取3份芹菜叶粉末0.5g，于正交试验最佳提取条件下进行提取，定容后按标准方程测其初始吸光度，并将装有提取液的3支容量瓶，1支置于日光下照射，另2支分别在室内自然光下和暗箱药品柜中放置,每隔1d测其吸光度，共测定4次，并将每天测得的吸光度值与初始吸光度对比分别计算，得出黄酮的保存率含量。光照对芹菜叶黄酮稳定性的影响0510152025系列 1系列 2系列 3系列 4日光照射自然光暗箱柜光照对芹菜叶黄酮稳定性的影响由图3-7可知，黄酮提取液在日光、自然光、避光下放置2d，其黄酮提取液保存率分别为93.6%，94.3%，94.3%，放置4d，其黄酮保存率分别为81.5%，87.2

12、%，91.5%。可见，日光对芹菜叶中黄酮稳定性有一定影响,自然光对芹菜叶中黄酮的稳定性影响不大,避光条件下芹菜叶中黄酮的稳定性较好。加热时间对黄酮稳定性的影响加热时间对黄酮稳定性的影响准确称取芹菜叶粉末0.5g，于正交试验最佳提取条件下进行提取，定容后按标准方程测其初始吸光度，并将装有提取液容量瓶放在水浴锅中进行加热，分别在20、30、40、50、60、70、80、90测量其吸光度，与初始吸光度对比分别计算，得出黄酮的保存率含量。加热时间对黄酮稳定性的影响0204060801001202030405060708090保存率加热时间对黄酮稳定性的影响由图3-8可知，在2060下，热对芹菜黄酮的稳

13、定性几乎没有影响，在70是保存率为78.3%，在70以上时分解加速，90时保存率为58.9%。说明高温对芹菜黄酮稳定性具有影响。pH对芹菜叶黄酮稳定性的影响以柠檬酸-柠檬酸钠为缓冲体系，研究了不同pH值对芹菜叶总黄酮热稳定性的影响。实验结果见图3-9。由图可见，芹菜总黄酮的热稳定性随pH值增大而减弱。因此，在利用芹菜总黄酮加工保藏食品时，在食品感官品质允许的情况下，应尽量采用较低的pH值。pH对芹菜叶黄酮稳定性的影响00.10.20.30.40.50.60.70.80.91234567保存率红外扫描光谱芦丁的结构中含有各种具有红外吸收的官能团，其中-OH基团在36503500cm-1处峰形尖，

14、吸收强。当-OH基团浓度大时，波峰移至35003200处，峰形较宽。其中的芳环在16201480cm-1处具有4个波峰，15001480 cm-1最强，16201590 cm-1其次，1580 cm-1较弱，450 cm-1常观测不到。-C=O基团在16001850 cm-1具有吸收峰。-CH基团在27003000 cm-1具有吸收峰。红外扫描光谱由图3-10可知，在32003500 cm-1处，具有较强的吸收值且波形较宽，说明有大量-OH基团存在。在14711519 cm-1处具有一个明显的吸收峰，说明物质中含有芳环。在18562956 cm-1处有一个较小的吸收峰，说明有-CH键的存在。在1647 cm-1处具有一个吸收峰，说明有-C=O基团存在。图中粗品的曲线的吸收峰在32003500 cm-1处、14711519 cm-1处、18562956