铁离子对迟缓爱德华氏菌生物膜形成和基质组成的影响湖南

1、湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项 目 申 报 表项目名称: 铁离子对迟缓爱德华氏菌生物膜形成和基质组成的影响学校名称湖南农业大学学生姓名学 号专 业性 别入 学 年 份钟为铭201440566114水族科学男2014级钟浪201440566118水族科学男2014级叶涛201440566113水族科学男2014级王雅琳201440566111水族科学男2014级陈康勇201440566135水族科学男2014级指导教师高志鹏职称讲师项目所属一级学科水产学学生曾经参与科研的情况参与学生均无参与科研的经历。指导教师承担科研课题情况1、国家自然基金面上项目，鲶爱德华氏菌型与型分泌系统致病的分

2、子机制研究，2010-2012，参与。2、国家自然基金面上项目，鲶爱德华氏菌多拷贝质粒pEI1和 pEI2编码的毒力蛋白的分子致病机理研究，2012-2015，参与。项目研究和实验的目的、内容和要解决的主要问题一、目的和意义迟缓爱德华氏菌作为重要的鱼类病原菌，其致病性与生物膜形成密切相关，而Fe3+又与细菌生物膜的形成、结构和基质组成密切相关。因此，本研究拟通过结晶紫染色、CLSM、SEM和FilmTracer LIVE/DEAD® kit染色等方法，研究Fe3+在迟缓爱德华氏菌生物膜形成、结构和生物膜内细菌生存能力等方面的作用；通过利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术和S

3、YPRO® Ruby染色、FITC-ConA染色和DDAO染色等方法分别研究Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜基质中蛋白质、多糖和胞外DNA的分布和形成的影响。最终阐明Fe3+在迟缓爱德华氏菌生物膜形成中的作用机理，迟缓爱德华氏菌与耶尔森氏菌和沙门氏菌等人类病原菌同属于肠杆菌科，研究Fe3+在迟缓爱德华氏菌生物膜形成中的作用机理，可为人类主要肠道病原菌的相关研究提供重要的理论依据。同时，也为阻止和破坏生物膜形成而造成的药物抗性提供理论依据。二、项目研究内容及实施方案1、Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜形成的影响（1）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生长的影响利用分光光度计测定迟缓爱德华氏菌在以下三

4、种培养条件下、在不同生长时间（0-36 h）菌液的吸光度值（波长540），即OD540的值，并绘制出相应的生长曲线，比较迟缓爱德华氏菌在三种不同培养条件下生长情况的差异。三种培养条件分别为：只加培养基（DMEM）；培养基（DMEM）+FeCl3；培养基（DMEM）+ FeCl3+乙二胺四乙酸（EDTA，铁离子螯合剂）（2）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜形成过程的影响利用结晶紫染色法（Crystal violet stain）和激光共聚焦成像法（CLSM）比较迟缓爱德华氏菌在上述三种培养条件下、在4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、和24 h时生物膜的形成能力和发展情况。（3）Fe3+

5、对迟缓爱德华氏菌生物膜结构的影响利用扫描电镜（SEM）和激光共聚焦显微镜（CLSM）观察在上述三种培养条件下迟缓爱德华氏菌生物膜结构的变化和差异，并利用Zen和COMSTAT等软件分析生物膜的细菌密度（Cell density）、粗糙度（Roughness）、厚度（Thickness）等结构指标。（4）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜中细菌生存能力的影响利用FilmTracer LIVE/DEAD® kit染色方法和激光共聚焦（CLSM）成像技术比较上述三种培养条件下迟缓爱德华氏菌生物膜内细菌的生存能力。在染色过程中，SYTO® 9染料（绿色）可以标记生物膜中所有细菌（包括完

6、整细胞膜-活菌、不完整细胞膜-死菌）的细胞核，而propidium iodide（PI、红色）染料只能标记细胞膜损伤（即死菌）的细胞核。因此在整个生物膜中，活菌被标记成绿色，而死菌被标记成红色。2、Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜基质组成的影响（1）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜中蛋白质组成的影响利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术和SYPRO® Ruby染色方法比较上述三种培养条件下迟缓爱德华氏菌生物膜中蛋白质组成的差异。（2）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜中胞外多糖（EPS）组成的影响利用FITC-ConA染色方法和激光共聚焦（CLSM）成像技术比较上述三种培养条件下迟缓

7、爱德华氏菌生物膜中胞外多糖的定位和组成差异。（3）Fe3+对迟缓爱德华氏菌生物膜中胞外DNA（eDNA）组成的影响利用DDAO 7-hydroxy-9H-(1,3-dichloro-9,9-dimethylacridin)染色方法和激光共聚焦（CLSM）成像技术比较上述三种培养条件下迟缓爱德华氏菌生物膜中eDNA的定位和组成差异。国内外研究现状和发展动态一、迟缓爱德华氏菌是危害水产殖业的重要致病菌迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda，E.tarda）属于变形菌门、-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、爱德华氏菌属，同属还包括鲶鱼爱德华氏菌（E.ictaluri）和保科爱德华氏菌（E

8、. hoshinae）。迟缓爱德华氏菌是一种革兰阴性的兼性胞内寄生菌，其生理生化特性与同科的大肠杆菌（Escherichia coli）和沙门氏菌（Salmonella）相似。迟缓爱德华氏菌感染宿主广泛，包括鱼类（淡、海水）、哺乳类、两栖类、爬行类、鸟类等，同时是爱德华氏菌属中唯一感染人类的种类，一般通过接触或食用携带病原菌的水产品进入人体(Leung et al., 2012; Michael and Abbott, 1993; Thune et al., 1993)。对于水产养殖业，迟缓爱德华氏菌是重要的病原菌之一，可感染多种淡、海水鱼类，如牙鲆（Paralichthys olivaceu

9、s）、鳗鲡（Anguilla japanica）、真鲷（Pagyrus major）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、罗非鱼（Tilapia nilotica）、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）等，其感染会引起鱼类迟缓爱德华氏菌病(Edwardsiellosis)，症状主要表现为体表溃疡和出血、腹部积水肿胀、肝脏囊肿、肠内出现黏液等。迟缓爱德华氏菌引发的暴发疾病已经给美国、欧洲、亚洲等许多国家带来了极其严重的经济损失，然而目前还未建立起成熟的防治措施，因此对迟缓爱德华氏菌致病机理的研究日显迫切。二、迟缓爱德华氏菌致病性与生物膜形成密切相关生物膜（biofil

10、m）是指微生物为适应周围环境，粘附于生命的或非生命介质表面，并被其自身分泌的胞外基质（Matrix）包裹而形成的一种稳定的、紧密的、复杂的、高度异质的聚合三维网状结构(Branda et al., 2005; HallStoodley and Stoodley, 2009; Kolter, 2010) 。生物膜的形成基本分为5个时期：浮游状态（planktonic）、粘附（attachment）、微菌落形成（microcolony formation）、成熟生物膜形成（macrocolony formation）和离散（dispersal）(Hall-Stoodley et al., 2004

11、; O'Toole et al., 2000) 。生物膜中的微生物定植于基质中。基质是微生物自身产生的的胞外聚合物质。生物膜中基质含量超过90%，而微生物总量不到10%。基质是各种不同的生物聚合物的组合，这些聚合物被称为胞外多聚物质（extracellular polymeric substances (EPS)）。基质是生物膜三维机构的重要框架支撑，也是微生物粘附于介质表面和生物膜内部聚合力的重要参与者。基质使得微生物能够抵抗干燥、氧化、紫外线、抗菌剂和宿主免疫等。基质的主要成分包括胞外多糖（extracellular polysaccharides）(Flemming et al.

12、, 2007; Sand and Gehrke, 2006; Tielen et al., 2005)、蛋白质、胞外DNA（eDNA）(Mulcahy et al., 2008; Vilain et al., 2009)等。生物膜参与65%以上的感染，尤其是与医疗器械相关的、机体表面的（如皮肤、软组织等）和慢性的感染，原因是生物膜对宿主防御和抗菌剂具有很强的抵御力(Costerton et al., 1999; Hall-Stoodley et al., 2004; HallStoodley and Stoodley, 2009) 。因此，可以推测迟缓爱德华氏菌生物膜的形成一方面可增强其致病性

13、，另一方面可增强其对宿主防御和抗菌剂的抵抗力，进而增加免疫防治的难度。因此开展迟缓爱德华氏菌生物膜相关研究对于迟缓爱德华氏菌的防治具有重要意义。三、Fe3+与生物膜形成密切相关Fe3+是细菌生存的必要因素之一。外界环境中的Fe3+浓度（1018 M）远远低于细菌生长所需要的浓度（107 M）(Weinberg, 1978)，因此细菌需要通过不同的铁转运系统从宿主获取足够的Fe3+。同时细菌的铁离子获得系统和毒力基因往往通过Fe3+相互调节(Litwin and Calderwood, 1993)。Fe3+作为细菌的关键营养因素可以调节多种细菌的生物膜合成，而这种调节在不同种类的细菌中起着截然不

14、同的作用。一方面，Fe3+的缺乏促进生物膜形成。例如，Fe3+的缺乏可以促进金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜的形成(Johnson et al., 2005)；嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）在富含Fe3+的条件下生物膜的形成受到抑制(Hindré et al., 2008)；变形链球菌（Streptococcus mutans）在缺乏Fe3+的唾液中生物膜形成能力增强(Francesca et al., 2004)；相反的，另一方面，Fe3+的缺乏抑制生物膜的形成。例如，大肠杆菌（E. coli）在铁离子浓度较低的培养条件

15、下生物膜的形成受到抑制，而这一调控的原理是Fe3+通过IscR（一种铁离子调控基因）调控I 型菌毛（type I fimbriae）的表达，进而控制大肠杆菌在介质表面的粘附，最终调控生物膜的形成(Wu and Outten, 2009)。霍乱弧菌（Vibrio cholerae）在铁离子浓度较低的培养基中不能形成生物膜(Mey et al., 2005)。Fe3+的缺乏可抑制苛养木杆菌（Xylella fastidiosa）生物膜的形成(Koh and Toney, 2005)。然而，即使对于同种细菌Fe3+对于生物膜形成的调控也是非常复杂的，例如在这一方面研究较为透彻的条件致病菌铜绿假单胞菌

16、（Pseudomonas aeruginosa）。Fe3+的缺乏可通过阻止早期细菌微菌落的形成进而抑制生物膜的形成(Banin et al., 2005)；相反，枸橼酸铁铵等含铁盐类通过依赖剂量的方式抑制生物膜的形成，当把已形成的生物膜转移至富含Fe3+的培养基中是，生物膜可以被破坏和清除(Musk et al., 2005)。综上所述，Fe3+是影响细菌生物膜的形成和结构的重要因素，然而影响的结果却与细菌种类相关，目前还未见Fe3+与迟缓爱德华氏菌生物膜形成相关的研究，本研究的开展将揭示Fe3+是如何影响迟缓爱德华氏菌生物膜形成、结构和基质组成，进而丰富Fe3+对细菌生物膜的作用机制，同时为

17、生物膜的防治提供理论依据。参考文献：Banin, E., Vasil, M.L., Greenberg, E.P., 2005. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United states of America 102, 11076-11081.Branda, S.S., Vik, Å., Friedman, L., Kolter, R., 2005. Biofilms: the matrix revisi

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