分子荧光分析法实验

1、实验实验4 分子荧光光谱法测定分子荧光光谱法测定维生素维生素B2的含量的含量光光谱谱分分析析原原子子光光谱谱（略略）分分子子光光谱谱分分子子吸吸收收U UV V- -V Vi is s（紫紫外外- -可可见见）I IR R（红红外外）分分子子发发光光光光致致发发光光其其它它发发光光形形式式如如：化化学学发发光光等等荧荧光光、磷磷光光(对光的吸收对光的吸收) 当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发具有特征频率的辐射能，分子从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激态，分子在较高能级的激发态时，它可能处

2、于激发态中各种振动状态的一种。然而由于分子通过发态中各种振动状态的一种。然而由于分子通过与溶剂分子，同类分子或其他分子的碰撞，而失与溶剂分子，同类分子或其他分子的碰撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发光。但当分子从激发态的最低在此过程中并不发光。但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级降振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级降落至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形落至基态的各个不同的振动能级时，则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光即是荧光式辐射出能量，所辐射出的光即是荧光。21V=0321V=0

3、21V=0S0S1S2T1发生激发发生激发态反应态反应分子内的激发和衰变过程分子内的激发和衰变过程21V=0A1A2VRFiciscPVR激发态能量的跃迁与转激发态能量的跃迁与转 化的形式和速率：化的形式和速率：A1,A2 吸收吸收: 10-15 sVR 振动松弛：振动松弛： 10-12 sic 内转化：内转化： 10-11 sisc 系间窜越：系间窜越： 10-6 10-2 sF 荧光：荧光： 10-9 10-6 sP 磷光：磷光： 10-6 100 s 当固定激发光波长和强度不变，当固定激发光波长和强度不变，而记录荧光强度随波长变化的曲线，而记录荧光强度随波长变化的曲线，称为称为发射光谱发

4、射光谱。若固定荧光最强处的。若固定荧光最强处的荧光波长不变而改变激发光波长，记荧光波长不变而改变激发光波长，记录荧光强度随激发光波长变化的曲线，录荧光强度随激发光波长变化的曲线，称为称为激发光谱激发光谱。2503003504004505005506000200400600800 Ex.Wavelength (nm)Relative Fluorescence Intensity激发光谱激发光谱发射光谱发射光谱任何荧光化合物，都具有两种任何荧光化合物，都具有两种特征的光谱：特征的光谱：激发光谱激发光谱和和发射光发射光谱谱。组成、结构与衍化信息组成、结构与衍化信息 物质的化学结构物质的化学结构 环境

5、与介质条件环境与介质条件 与其它溶质的相互作用与其它溶质的相互作用 反应动力学反应动力学F = KI0fC I I0 0：光源强度；：光源强度；f f：荧光量子产率；：荧光量子产率；C C：荧光体浓度）：荧光体浓度）试比较荧光法与紫外试比较荧光法与紫外- -可见分光光度法的分析性能。可见分光光度法的分析性能。?问题：问题：55056057058059060061062006001200180024003000360042004800C Fluorescence IntensityWavelength(nm)（注意：注意：在一定浓度范围内适用）在一定浓度范围内适用）？问题问题：荧光光度计与紫外荧

6、光光度计与紫外- -可见分光光度计在光路设置可见分光光度计在光路设置 上有什么不同？为什么？上有什么不同？为什么？ 常规分析应用：常规分析应用： 定性分析：定性分析：f；ex；em；峰形等；峰形等 定量检测：定量检测： F = KI0fC 其它（略）其它（略） 高端生化研究：高端生化研究： 分子相互作用研究；分子相互作用研究； 代谢动力学跟踪；代谢动力学跟踪； 显微成像显微成像（物理迁移与化学衍化的原位（物理迁移与化学衍化的原位“显迹显迹”）2.1 2.1 实验原理实验原理 维生素（核黄素）在一定波长的维生素（核黄素）在一定波长的激发光照射下会发射出绿色荧光，根据荧激发光照射下会发射出绿色荧光

7、，根据荧光强度在一定浓度范围内与荧光物质浓度光强度在一定浓度范围内与荧光物质浓度成正比，用标准曲线法对样品进行定量分成正比，用标准曲线法对样品进行定量分析，在线性良好的情况下，也可用浓度直析，在线性良好的情况下，也可用浓度直接读出被测样品的浓度。接读出被测样品的浓度。 1、VB2的荧光光谱的绘制的荧光光谱的绘制2、标准工作曲线的制作、标准工作曲线的制作3、未知液的测定、未知液的测定1.开机：开机： 打开打开RF-5301荧光分光光度计的电源开关，打印机开荧光分光光度计的电源开关，打印机开关，开启电脑。预热仪器关，开启电脑。预热仪器20分钟。分钟。2. 配制系列维生素标准溶液：配制系列维生素标准

8、溶液： 取取5个干净的个干净的50ml容量瓶，分别加入容量瓶，分别加入1.0, 2.0, 3.0, 4.0 , 5.0ml浓度为浓度为10.0g/ml的维生素标准溶液用水稀释的维生素标准溶液用水稀释至刻度，摇匀。至刻度，摇匀。 3.仪器自检：仪器自检： 预热仪器预热仪器20分钟后，双击电脑桌面上分钟后，双击电脑桌面上“RF-530XPC”图标，仪器在计算机的引导下开始自检，约图标，仪器在计算机的引导下开始自检，约3分钟完毕，此分钟完毕，此时仪器操作软件打开。时仪器操作软件打开。 若此时软件为若此时软件为“光谱测定光谱测定”模式，则点击模式，则点击“Acquire Mode”主菜单，在下拉菜单中

9、选择主菜单，在下拉菜单中选择“Quantitative”，此时软，此时软件转为件转为“定量测定定量测定”界面模式。界面模式。4. 参数设定：参数设定： “定量测定定量测定”界面模式下，点击界面模式下，点击“Configure”主菜单，主菜单，在下拉菜单中选择在下拉菜单中选择“Parameters”菜单，则会自动弹出菜单，则会自动弹出“Quantitative Parameters”窗口，在此窗口中，需要设窗口，在此窗口中，需要设置以下五个参数：置以下五个参数： 在在“EX Wavelength”中填中填270， 在在“EM Wavelength”中填中填525， 在在“Slit Widthnm

10、 EX”中填中填10， 在在“Slit Widthnm EM”中填中填10， 在在“Sensitivity: High Low” 中选中选 Low，其他参数，其他参数选默认值，不要调整它们，参数设置好后，按选默认值，不要调整它们，参数设置好后，按“OK” 此时软此时软件自动回到件自动回到“定量测定定量测定”界面模式。此时仪器参数设置完毕。界面模式。此时仪器参数设置完毕。5.空白溶液测试：空白溶液测试： 设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样设置好仪器的工作条件后，把装有去离子水的样品池置于试样架内，在荧光光路上插入架内，在荧光光路上插入35滤光片，合上样品室盖子，在计滤光片，合

11、上样品室盖子，在计算机屏幕上点击算机屏幕上点击“AUTO ZERO”，观察屏幕右下脚的基线值接近，观察屏幕右下脚的基线值接近零时，再点击零时，再点击“READ”读数，得空白溶液数值。读数，得空白溶液数值。6.系列维生素标准溶液的测试：系列维生素标准溶液的测试： 把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测把各标准样品按从稀到浓的顺序置于试样架内，和空白溶液测试方法相同，分别测定不同浓度标准溶液的相对荧光强度。试方法相同，分别测定不同浓度标准溶液的相对荧光强度。7. 未知试样的测定：未知试样的测定： 将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定将已配制处理好的未知试样装入样品池置于试样架内，用测定标准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。标准溶液相同的条件，测其相对荧光强度。8. 关机：关机： 先关计算机，再关仪器，打印机；清洗样品池，容量瓶等玻璃先关计算机，再关仪器，打印机；清洗样品池，容量瓶等玻璃仪器，整理