海藻糖二十碳五烯酸酯的合成与表面性能(翻译)

1、海藻糖二十碳五烯酸酯的合成与表面性能摘要：海藻糖二十碳五烯酸酯是以二十碳五烯酸乙酯和海藻糖为底物，利用微生物脂肪酶在叔丁醇中通过脂基转换合成的。反相高效液相色谱法加上二极管阵列检测和电喷雾质谱（RPHPLC-DAD-ESI-MS）分析表明，该反应混合物中存在单酯和二酯。采用硅胶柱色谱法预处理反应混合物，然后再用高效液相色谱法洗脱海藻糖二十碳五烯酸酯，进一步纯化。通过ESI-MS和核磁共振（NMR）对该化合物的结构进行表征。证实，单酯为 6-O-海藻糖二十碳五烯酸单酯。接着，我们将海藻糖二十碳五烯酸酯的表面性能进行了研究。结果显示表面张力，cmc 和Gomic随着温度的升高降低，但是每个分子占据

2、的面积略有增加。关键词：海藻糖二十碳五烯酸酯、酯基转移反应、分离纯化、结构鉴定、表面特性介绍膳食长链脂肪酸的二十碳五烯酸（EPA，20：5n- 3）属于n-3不饱和脂肪酸（多不饱和脂肪酸），其具有多种生物活性，并有生理功能1,2。一些研究表明，它可用于预防和治疗心血管疾病3-5。Stulnig6和Li7报道表明EPA可以从膜筏置换酰基化蛋白质，从而调节免疫应答。EPA也可以在各种炎症的治疗临床应用作为辅助免疫抑制剂。西田8提供的研究表明，EPA可能对H2O2氧化损伤起到内源性保护作用。Mori 9也显示EPA可降低体内氧化应激。哈德曼10发现，EPA可以增加抗癌药物的有效性。巴布科克11报道，

3、EPA补充剂可以促进保持体重和抑制肿瘤发展。此外，一些文章也显示出n- 3脂肪酸可以对人类癌症治疗有帮助12-14。EPA也作为预防医学治疗的推荐措施。乙基二十碳五烯酸的酯已经被用于在动脉硬化性闭塞症，高血脂的治疗15。然而，EPA是不稳定的，很容易在暴露于氧或活性氧中被氧化成脂质自由基或脂质过氧自由基。虽然，在PUFA的主体相氧化已经研究充分，也有一些研究表明该多不饱和脂肪酸的在主体相的氧化稳定性从水性体系中16,17显著不同，Endo等人的报道称甘油三酯的氧化含有二十碳五烯酸和二十二碳六酸取决于氧化系统和甘油三酯结构。Chaiyasit等人认为界面膜属性的改变与表面活性剂的属性有关，同时表

4、面活性剂性能影响油包水乳液液滴的氧化。为了更好地理解多不饱和脂肪酸在具有最小影响因素的水溶液中的氧化，我们使用胶束作为模型系统。我们所用的两性的EPA酯是具有表面活性的，并且可以在水溶液中作为一个起作用表面活性剂。海藻糖是在自然界中很稳定寡糖，是一个非还原性糖，海藻糖具有热稳定性及不发生美拉德反应。根据Kohya20和Okabe 21报道，海藻糖有抗肿瘤作用。因此，我们使用海藻糖作为羟基提供者。 Cerda'n等22报告了从多不饱和脂肪酸浓缩甘油鱼肝油经酯化生产高度EPA-和富含DHA的甘油三酯。Shimada等人23认为可通过酶法催化二十二碳六，二十碳五，花生四烯酸，和c-亚麻酸的合

5、成固醇酯。Yamamura 24报道的方法以纯化十二碳六烯酸乙酯和二十二碳五烯酸乙酯。然而，很少有数据提供两性海藻糖的分离和纯化酯EPA的。在这里，我们采用高效液相色谱法结合硅胶柱色谱法纯化海藻糖二十碳五烯酸酯。此外，我们探讨了海藻糖二十碳五烯酸酯在水溶液的表面性质。材料和方法材料：Novo435（南极假丝酵母脂肪酶B固定在一大孔聚丙烯树脂）购自购的Novozyme（Bagsvaerd，丹麦）。海藻糖二水合物（纯度>98）是从ST公司（上海，中国）购得。EPA乙酯（纯度>70）由无锡市迅达海洋生物制品检定所购得（中国，无锡）。高效液相色谱法级甲醇是从江苏Hanbon科技有限公司获得

6、（淮安，中国）。分析纯其它试剂均为从中国医药集团（上海，中国）购得。海藻糖二十碳五烯酸酯在间歇式反应器合成。海藻糖（0.75克，在干燥器中预干燥）和EPA乙酯酯（1.96克）混合，用150毫升叔丁醇。该缩合反应，从加入脂肪酶（0.75克）开始。该棕色反应容器充满惰性氮塞住后固定在定轨摇床上，其装有一个连续振荡温控器（上海景洪实验室仪器有限公司有限公司，中国上海）设定在50和以150rpm转速工作48h。溶剂在使用前用脱水分子筛（4埃）过滤至少24h。海藻糖二十碳五烯酸酯纯化：使用RPHPLCDAD-ESI-MS的反应混合物进行分析，然后在硅胶柱进行预分离纯化，再使用HPLC。分析该反应混合物的

7、RPHPLC-DAD-ESI-MS，由Waters ZMD平台4000系统组成。该系统包括了Micromass ZMD质谱仪和配备有沃特斯996二极管阵列检测器（沃特斯公司，米尔福德，MA，USA）的Waters2690 HPLC构成。数据用是用MassLynx处理软件4.0版本（Micromass，沃特斯的子公司，富康，MA，USA）。反相ODS-A色谱柱（250mmX94.6mm，内径和粒径5m，YMC，日本）用于在柱温设定在35进行分离。将预处理的反应混合物取样10L注入到HPLC中。用0.3甲酸（溶剂A），甲醇（溶剂B）和己烷（溶剂C）以1ml/min恒定流速梯度洗脱。其线性梯度分布型

8、如下：15A，85B，0C启动，然后在15min时0A，100B和0C，然后在20min时0A，90B和10C，在25min是15A，85B和0C落回。该峰用二极管阵列检测器检测。海藻糖二十碳五烯酸酯的混合物在205nm处进行分析。大规模的频谱是通过电喷雾电离的正面和负面的模式获得。离子电压使用如下：毛细管4.23kV（负）和4.20kV（正），锥36 v（负）和36 V（正），提取5 V和光电倍增器650 V.源块温度为100和去溶剂化温度为250。该分析仪真空度是2.6e-5mBar。连续大规模光谱是由200到1400 M / Z连续扫描获得。硅胶柱色谱条件如下：流动相梯度正己烷-异丙醇-

9、甲醇5：4：1（v/v/v）和4：4：2（v / v/ v）依次被使用。流速为1.3ml/min，洗脱液的收集与分析采用薄层色谱法。海藻糖二十碳五烯酸酯薄层色谱分析在硅胶上进行预涂板（25mm×75mm，青岛海洋化工有限公司，青岛，中国）。薄层流动相为乙基乙酸乙酯/甲醇/水（8.5/ 1 /0.5，v/v/v）并用碘液显影。这两个海藻糖单酯和双酯都出现褐色斑点。因此是海藻糖二十碳五烯酸酯混合物。半制备性HPLC进行纯化，使用的是Waters的Sunfire-C18色谱柱（150mm×19mm，内径，10m）。纯化使用甲醇和水（85:15的混合物，v/v）在35进行洗脱。流速

10、为8ml/min和样品的注入体积为1ml。将产物在205nm处检测，然后收集用液相色谱法进一步分析鉴定并通过质谱（MS）和核磁共振（NMR）鉴定。海藻糖二十碳五烯酸酯鉴定：海藻糖二十碳五烯酸酯的纯度通过半制备性HPLC，其使用岛津制作所的LC-20A装置与使用Waters的Sunfire-C18色谱柱（150mmX94.6mm，内径，5m）测定，甲醇和水（85:15，v/v）在35作为混合物中洗脱剂。样品的施加量为10L，洗脱液的流速为1mL/min。利用PDA检测器进行含量分析。纯净的化合物结构研究是根据使用上述Bruker方法和NMR鉴定进行的，使用MS分析AM-500光谱仪（Bruker

11、公司分析仪器，Rheinstetten的，德国），在500MHZ测定1 H和13 CNMR。氘甲醇（CD3OD）作为溶剂，四甲基硅烷（TMS）作为内标物。亲水亲油平衡值（HLB）的计算:根据格里芬25，HLB值是尺寸和亲水性和亲脂性部分表面活性剂分子的强度的平衡。可通过下式计算HLB值：HLB = 20 X（亲水基团的分子量/总的表面活性剂的分子量）克罗夫特26表示，如果乳化剂是更可溶于水相中的，然后就可以形成油包水乳液。正如预期的那样，根据HLB值的界定，具有高的HLB值的材料形成O / W乳化剂，而具有低HLB值的材料会形成W / O型乳化剂。HLB值在3-6范围内被认为是W / O乳化；

12、值在8-18内被认为是O / W乳化27。表面张力测量：海藻糖二十碳五烯酸酯溶于二次蒸馏水。水溶液的静态表面张力使用KRUSS的K-12张力计测得的基于该DU Nouijy（KRUSS GmbH的，汉堡，德国）环方法，基于一浓度分别在30，40，50，和60的函数。该测量在稀溶液中开始，然后挂几何形状确切已知的水平白金环（R =0.955厘米），使用二次蒸馏水校正表面张力。每次测量之前通过燃烧（煤气灯）去除铂金环残留的沉积物。环浸入液体进行测量然后再拉出再次测量。该最大表面张力需要通过拉环表示在MN M-1上。每条曲线所示是三个重复实验的平均结果。CMC与CMC评价：临界胶束浓度（CMC）是一

13、种特征值用于在限定的温度和特定的溶剂中的测定给定的表面活性剂。海藻糖二十碳五烯酸酯的CMC值水溶液从打破表面张力Ç计算得到浓度曲线对数。CMC是对应于CMC中的表面张力。结果与讨论海藻糖二十碳五烯酸酯的纯化:RPHPLC-DAD分析表明，该反应混合物是含有单酯，二酯和其它杂质的复杂系统（图1）。主要离子通过HPLC-DAD-ESI-MS检测：海藻糖二十碳五烯酸酯（要求，M1 626.33，M1+Na + 649.55，M1+ K+ 665.44，2M1+Na+ 1276.12；M1-H- 625.65，M1 + HCOO- - 671.62，2M1-H- 1252.16；海藻糖单酯（

14、需M2 910.54，M2+Na+ 933.96，M2+ K+ 949.98，M2- 910.07，M2+ HCOO- - 956.02）（图2）。含有单酯和二酯的反应混合物中进行过滤，除去固定脂肪酶。该剩余混合物在减压下浓缩，然后利用硅胶柱色谱法过滤。玻璃层析柱用锡纸包裹挡住光线，隔离工艺利用TLC监测。海藻糖单酯和海藻糖双酯的Rf值分别为0.354和0.649，这表明该硅胶柱色谱法的条件是合理的，反应混合物可能是足够分开。要获得具有较高纯度的产品，从硅胶柱上海藻糖二十碳五烯酸酯开始进一步通过半制备HPLC纯化。HPLC收集对应峰的保留时间为13.2-15.5min，并进行分析。单峰表示化合

15、物没有杂质，并没有包含异构体化合物。这是因为固定脂酶在溶剂中具有优异朝向伯羟基6-OH（对应于非还原葡萄糖部分）的特定选择性28,29。此外，海藻糖是一种对称的分子，并拥有两个相同主要位置的羟基C6和C6。所述海藻糖二十碳五烯酸酯标识通过NMR和MS进一步证实.海藻糖二十碳五烯酸酯的结构解析：纯化海藻糖二十碳五烯酸酯的化学结构在重甲醇中通过1H NMR（500 MHz），13C NMR（500 MHz）确定。MHz) and13C NMR (500 MHz) in deuterated methanol. 1H NMR(500 MHz, CD3OD) (ppm): 5.35 (10H, m),

16、 5.09 (1H, d,J = 3.7 Hz), 5.07 (1H, d, J = 3.7 Hz), 4.32 (1H, d,J = 11.5 Hz), 4.18 (1H, dd, J = 11.2, 5.0 Hz), 4.00 (1H, m),3.80 (4H, m), 3.62 (1H, dd, J = 11.8, 5.2 Hz), 3.41 (2H, m),3.33 (2H, m), 2.83 (8H, m), 2.35 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.10(4H, m), 1.65 (2H, m), 0.96 (3H, t, J = 7.5 Hz); 13C NMR(5

17、00 MHz, CD3OD) (ppm): 95.542 (C1), 73.476 (C2),72.200 (C3), 71.699 (C4), 74.787 (C5), 64.824 (C6), 95.406(C1), 73.512 (C2), 72.228 (C3), 71.699 (C4), 74.954 (C5),62.943 (C6)。相应于二十碳五烯酸残基中的碳原子具有下列值：175.504(C = O), 133.108, 130.305, 130.221, 129.764, 129.538,129.494, 129.430, 129.404, 129.236, 128.494

18、(都是CH = CH C)；34.697, 26.231, 26.735, 26.857,27.834, 27.834, 26.857, 21.785 (都是 CH2C)，和14.941 (CH3). MS和NMR分析鉴定化合物，为6-O-海藻糖二十碳五烯酸酯。MS:m/z 649.55 M+Na+, 665.44 M+K+; 625.65 M-H-,1252.16 2M-H- 海藻糖二十碳五烯酸酯的表面性能：海藻糖二十碳五烯酸酯的HLB计算值为10.89；因此，可以作为水包油对于其表面性能的研究。海藻糖二十碳五烯酸酯的测量表面张力示于图 3。CMC结果在不同温度下两性化合物突然改变，在采取表

19、面张力与浓度曲线结果表明，海藻糖二十碳五烯酸酯显著减少在水的表面张力。CMC值表明，表面张力的值迅速下降，而浓度的增加却改变非常缓慢。这是因为，如两性分子，海藻糖二十碳五烯酸酯由协同形成的胶束内核疏水烷基链的关联，从核心延伸到亲水头基水性介质中。只有在高于CMC浓度胶束数量增加。胶束获得无变化，因为疏水组位于胶束的内部，并且表面张力并没有进一步减少。结果还表明，海藻糖二十碳五烯酸酯的表面张力的值随温度升高而降低。当温度增加时，多个分子将溶液移入表面相，在溶液上气态分子密度增加，这削弱了分子间的吸引力，并减少界面相和体相之间的分子数之差，然后表面张力下降。海藻糖二十碳五烯酸酯的CMC值被发现随着

20、温度的增加（图4）逐渐减小。这是因为，在给定温度下，两性化合物的CMC值通过范德华力的平衡被约束，互动疏水烷基和水合之间胶束首基是倾向于向上突破的。脱水效果随着温度的升高增加分子的疏水性，因此胶束变得有利。于罗森27诸井30也发现类似的结果，他们认为CMC的结论说明两离子和非离子表面活性剂的值分别为一温度的函数。海藻糖二十碳五烯酸酯的CMC值被发现随着温度的增加而降低（图5）。那是因为分子间的距离随着温度升高，这就造成了一个分子和吸附分子之间吸引力减少，随之而来的包装较差的每个分子（A）在占据地区随着温度的升高增加。每区的估计分子中，A在单分子膜的区域，利用吉布斯计算出的表面过剩衍生吸附式。其

21、中U是表面过剩，R是通用气体常数（8.3 J mol-1 K-1），T是温度（K），是表面张力（mM m-1）和C是表面活性剂浓度（mol L-1）。每个分子的区域，A，可以因此很容易被计算出：其中NA是阿伏伽德罗常数（6.023X1023 mol-1）。作为在CMC是已知的吉布斯自由能吸附或胶束的标准自由能，一个单酰基海藻糖分子（GOmico）在液体表面进行了计算：CMC表达摩尔单位和molsolvent是每升水摩尔的绝对数量温度T， Gomico温度作图于图5。随着温度的增加，该Gomico走向呈一个负值指示趋势，从而更容易地形成胶束。结论使用非水的酯交换技术合成两种海藻糖二十碳五烯酸酯。

22、然后，它使用硅胶柱色谱法和半制备型HPLC纯化。将纯化的产物经质谱和核磁共振为6-O-海藻糖二十碳五烯酸酯。接着，对产品的水溶液进行表面特性研究。所获得的结果表明，表面张力，CMC，CMC和Gomico随温度增加降低。然而，该每个分子占据面积却增加的很少。未来研究将包括EPA水溶液的调查，所获得的信息将被应用到解释的EPA的氧化和其在水中的酯解参考文献1. Bougnoux P, Maillard V, Ferrari P, Jourdan ML, Chajes V (2002)IARC Sci Publ 156:3373412. Castro IA, Monteiro VCB, Barros

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