灯盏乙素在大鼠体内药代动力学及组织分布的研究

1、灯盏乙素在大鼠体内药代动力学及组织分布的研究尤海生1,董亚琳13,邢建峰2,张春玲3,王茂义1(1.西安交通大学医学院第一附属医院,陕西西安710061;2.西安交通大学医学院,陕西西安710061;3.西安市红十字会医院,陕西西安710061摘要目的:研究灯盏乙素在大鼠体内药代动力学和组织分布特性,为临床合理用药提供科学依据。方法:灌胃给予80mg kg -1的灯盏乙素,HP LC 测定大鼠体内灯盏乙素的血药浓度及组织中的浓度,血浆样品用固相萃取的方法处理,其他生物样品用液2液萃取法处理。结果:灯盏乙素在血浆和组织匀浆中线性范围分别为101280ng mL-1(R 2>0199和401

2、280ng g -1(R 2>0199,最低检测限分别为10ng mL -1和40ng g -1,日内、日间精密度均小于8%。主要药代动力学参数:达峰时间t m ax 为(717±110h,峰浓度C max 为(28810±7512ng mL -1,药时曲线下面积AUC 0t 为(516±116g mL -1h,MRT 0t 为(1715±114h 。结论:灯盏乙素口服后在体内呈非房室模型,药时曲线有双峰现象。关键词灯盏乙素;HP LC;药代动力学;组织分布中图分类号R 285.5文献标识码A 文章编号100125302(2007162168820

3、5收稿日期2006208210通讯作者3董亚琳,Tel:(02985323243,E 2mail:dongyalin medmail 灯盏花素(breviscap ine 是从菊科短莛属灯盏花全株植物中提取分离的黄酮类有效成分,主要成分为灯盏乙素(scutellarin,SCU ,具有扩张微血管,增加动脉流量,降低血液黏度,减少外周阻力,抑制血小板聚集等作用,临床用于治疗冠心病、心绞痛、心肌缺血损伤及脑血栓形成等1。关于口服灯盏乙素的体内药动学研究报道较少224,其组织分布研究未见报道。本研究拟建立HP LC 测定大鼠血浆及组织中灯盏乙素浓度的方法,研究灯盏乙素在大鼠体内的动力学和组织分布。1

4、材料1.1仪器与试剂美国W aters 公司高效液相色谱仪,包括W a 2ters2996二极管阵列检测器(DAD ,515型高压泵,W aters717自动进样器,Empower Pr o 色谱工作站。贝克曼的A llegraT M X -ZZR Centrifuge 低温离心机。灯盏乙素对照品(中国药品生物制品检定所,批号8422200102,纯度9614%;灯盏乙素(云南个旧生物药业有限公司提供,批号D2*,纯度9715%,甲醇(色谱纯,美国Fishers 公司生产,醋酸乙酯(分析纯,西安化学试剂厂,水为超纯水。1.2动物35只S D 大鼠,雌雄兼用,雄性20只,雌性15只,体重2502

5、80g,由西安交通大学实验动物中心提供(二级动物合格证号:陕医动字082005。2方法2.1色谱条件色谱柱phenomenex RC 18柱(416mm ×150mm ,5m ;柱温30;流动相甲醇2水(11(1mol L-1磷酸调pH 215;流速018mL m in -1;检测波长335n m;进样量50L 。2.2对照品溶液的配制精密称取灯盏乙素对照品8mg,置于100mL量瓶中,加入甲醇溶解并稀释至刻度,得灯盏乙素对照贮备液(80g mL -1,避光4冰箱保存。临用时将贮备液用流动相稀释至所需浓度,即得灯盏乙素工作液。2.3生物样品的采集制备与测定2.3.1血浆样品采集处理1

6、0只S D 大鼠,雌雄各半,禁食12h,自由饮水,尾静脉取血015mL 后以80mg kg -1的灯盏乙素灌胃,于给药后0117,015,1,2,3,5,8,12,24,36,48h 从大鼠尾静脉取血0158861mL,置肝素化离心管中,离心,3000rm in-1,15 m in分取血浆,于-20保存待测。固相柱(Oasis C18先以1mL甲醇和1mL水活化;取血浆样品012mL加入015%磷酸014mL,上柱,依次用水1mL、甲醇012mL清洗小柱;再以pH 310甲醇115mL洗脱,收集洗脱液,于35氮气流吹干,残渣以100L流动相涡旋溶解,取50L进样,在上述色谱条件下分离测定,记录

7、色谱峰面积,按标准曲线方程,计算血浆药物浓度。2.3.2组织样品的处理25只S D大鼠,雄性15只,雌性10只,10只(雌、雄各半用于方法学研究, 15只随机分为3组,分别给予灯盏乙素80mgkg-1,于给药后4,8,12h处死,取心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器,生理盐水冲洗表面血迹,滤纸吸干,冻存,待测。定量称取各脏器组织013g,加生理盐水制成组织匀浆液1mL。精密吸取匀浆液015mL,加1mol L-1的磷酸0125mL,醋酸乙酯310mL,涡旋振荡5m in,2500rm in-1离心10m in,连续萃取2次。合并萃取液,35氮气流吹干,流动相100L充分溶解,取50L进样。2.4统计

8、方法数据用 x±s表示,采用非房室模型法用DAS 210经统计矩计算,SPSS1010软件对给药后不同时间取样点进行t检验。3结果3.1专属性考察按选定的色谱条件,测定灯盏乙素对照溶液、服药前大鼠空白血浆、服药后大鼠血浆;服药前大鼠空白组织、服药后大鼠组织中灯盏乙素含量,按生物样品处理后进行色谱分析,见图1。大鼠血浆中的内源性杂质不干扰灯盏乙素的测定,灯盏乙素的保留时间为815m in。大鼠组织中的内源性杂质不干扰灯盏乙素的测定,色谱图略 。图1大鼠血浆中灯盏乙素的HP LC图A.未服药前空白血浆;B.灌胃灯盏乙素后的血浆3.2标准曲线的制备S D大鼠空白血浆012mL若干份,制备含

9、灯盏乙素浓度为1280,640,320,160,80,40,20,10ngmL-1的系列标准血浆样品,按血浆样品处理方法制备。以灯盏乙素峰面积(Y对浓度(X进行线性回归,得血浆标准曲线方程。S D大鼠空白组织匀浆015mL若干份,制备含灯盏乙素为2560,1280,640,320,160,80,40ngg-1的系列标准组织样品,按组织样品处理方法制备。以灯盏乙素峰面积(Y对浓度(X进行线性回归,得各组织标准曲线方程,结果见表1。表1灯盏乙素在大鼠血浆和各组织中的标准曲线(n=6样品标准曲线线性范围/ngmL-1(ngg-1R2LLOQ/ngmL-1(ngg-1血浆Y=163314X+10641

10、510128001999910心Y=35715X+32881840128001999740肝Y=30611X-2901840256001998540肾Y=33514X+45871340128001998940脑Y=36515X+12921240128001999840注:R2均>0199,满足生物样品的测定要求。信噪比S/N=3时,血浆和组织中样品最低检测限分别为10ngmL-1和40ngg-13.3精密度与回收率实验3.3.1血浆样品精密度与回收率试验取大鼠空白血浆溶液配制成高、中、低3个剂量(320,80,20 ngmL-1若干份样品,按血浆样品处理方法制备,进样50L,以3个剂量对

11、应相同的进样量的对照品进行分析,计算血浆样品的绝对回收率绝对回收率(%=血浆样品处理后进样所得峰面积/对应浓度的对照品的峰面积×100%。结果见表2。3.3.2血浆样品稳定性试验大鼠空白血浆溶液012mL加灯盏乙素的对照品,配制成高、中、低3个浓度(320,80,20ngmL-1若干份样品,分别0h、室温放置10h、样品处理后流动相复溶室温放置10 h、冻融2次、冰冻1个月后,按血浆样品处理方法制备,进样50L,测定灯盏乙素的浓度无明显降低(RS D<10%,结果稳定。3.3.3组织样品精密度与回收率试验取大鼠空9861表2大鼠血浆中灯盏乙素的精密度与回收率实验( x 

12、7;s,n =5加入量/ng mL-1日内测得量/ng mL -1RS D /%日间测得量/ng mL -1RS D /%相对回收率/%绝对回收率/%32033018±151221131718±20186169913±7186615±414808615±2183128418±21831310519±8146918±217202014±1134162012±11041810112±5117318±316白组织匀浆液015mL,加灯盏乙素对照品,组织处理方法制备,进样50L,以3

13、个剂量对应相同的进样量的对照品进行分析,计算组织样品的绝对回收率,结果见表3。表3组织匀浆液中灯盏乙素的精密度与回收率实验( x ±s,n =5样品加入量/ng g-1日内测得量/ng g -1RS D /%日间测得量/ng g -1RS D /%相对回收率/%绝对回收率/%心1280125716±9819719126511±57144159818±4157711±31532034015±261071632016±241271610012±7167918±519807813±2153127713

14、±1192149619±2138317±118肝1280132312±6019416127113±83136169913±6156518±41332034519±111231233910±111231310519±3157010±213808116±5116128019±31941010210±6146612±312肾1280126814±3414217121811±83106189512±6156919±

15、41732032312±251471832113±151341810011±4187610±315807617±1162117318±3164199016±4157014±313脑1280134015±2619210136615±321721410611±2148412±11932032918±211061431715±23127139918±7127914±517808016±0181107918±11921410

16、216±2138214±1173.3.4组织样品稳定性试验大鼠空白组织匀浆液015mL,加灯盏乙素对照品,配制成高、中、低3个剂量(1280,320,80ng g -1 若干份样品,分别0h 、室温放置10h 、样品处理后流动相复溶室温放置10h 、冻融2次、冰冻1个月,按组织样品处理方法制备,进样50L,结果表明样品稳定性良好,RS D <8%。3.4药动学研究血药浓度测定结果表明:大鼠灌胃给予灯盏乙素80mg kg -1后血浆中灯盏乙素的平均浓度2时间曲线(见图2。灯盏乙素口服后,受试动物的药时曲线有双峰现象,故采用非参数法计算药动学参数,10只大鼠灌胃给予灯盏乙

17、素80mg kg -1后主要药动学参数见表4,灯盏乙素在大鼠各组织中的分布见表5。图2灌胃80mg kg -1灯盏乙素在大鼠体内平均血药浓度2时间曲线表4灯盏乙素在大鼠体内的药动学参数( x ±s,n =10样品剂量/mg kg -1AUC 02t /h g mL -1AUC 02/h g mL -1MRT 02t /h MRT 02/h 灯盏乙素80516±116519±1171715±1141919±116样品剂量/mg kg -1T 1/2/hT max /hCL s/F /L h -1kg -1Vc /F /L kg -1C max /

18、g L -1灯盏乙素80917±114717±019712±21110114±341128810±7512表5灯盏乙素(80mg kg -1在大鼠各组织中不同时间的含量( x ±s,n =5ng g-1样品组织含量4h 8h12h心6312±22175816±25165011±1417肝12913±46145413±141424611±7182肾39113±201228719±7912118515±59143脑7117±27127717

19、±33154811±515注:与4h 比较1P <0105,2P <0101;与8h 比较3P <01054讨论本研究采用HP LC 2DAD 法测定大鼠灌胃给予灯盏乙素后的血和组织中的浓度,结果显示,血浆和组织杂质峰不干扰分析峰的测定,专属性强,相关系数和回收率达到了生物样品的测定要求,而且检测限低(10ng mL -1或40ng g -1,能够满足灯盏乙素药代动力学研究的要求。0961预试验结果表明,灯盏乙素在雌性和雄性大鼠间药代动力学参数无统计学差异。口服灯盏乙素药时曲线呈双峰现象,与文献2,528报道一致。本试验结果为011730m in出现第1个

20、药时曲线峰,79 h出现第2个药时曲线峰,对于药物药时曲线的双峰现象在中草药的单体成分中居多,文献对此现象的解释不一,有待进一步研究。对于双峰药时曲线的统计分析目前尚无一种通用的理想方法,国际上较常规的处理方法多采用非房室模型法,该法分析药物的体内过程,主要依据药时曲线下面积,不受数学模型的限制,普遍适用于任何房室状态。在本实验中采用DAS210软件进行数据处理,所得统计矩参数符合药代动力学变化趋势。预试验研究结果发现,灯盏乙素在雌性和雄性大鼠间组织分布无统计学差异,灯盏乙素在大鼠心、肝、肾、脑中含量较多;其他组织中含量较少达不到检测限。因此,选择了心、肝、肾、脑4种脏器进行了研究,结果表明,

21、在灌胃给药4,8,12h后灯盏乙素在肾脏含量最高,其次为心脏、肝脏、脑。大部分体内的药物可能以原形从肾脏排泄,尿药法药代动力学试验9证实了这一点。在肝组织中8,12h的药物含量与4h比较显著降低(P<0101,这表明灯盏乙素在肝药酶的作用下,部分药物发生了代谢转化。在心脏和脑组织中药物含量变化较小,文献10利用脑组织进行了灯盏乙素的药代动力学研究,结合本研究脑组织检测到大量的灯盏乙素。说明灯盏乙素能通过血脑屏障在脑组织分布。灯盏乙素有抗氧化和抑制血小板集聚的作用11,因此在血流丰富的心、脑组织分布的灯盏乙素有利于治疗和预防心脑血管疾病。参考文献1韦宁.灯盏花素的临床应用进展与不良反应J.

22、中国药师,2001,4(2:144.2葛庆华,周臻,支晓瑾,等.灯盏花素在犬体内的药动学和绝对生物利用度研究J.中国医药工业杂志,2003,34(12:618.3Huang J M,L i N,Yu Y Q,et al.Deter m inati on of aglycone con2jugated metabolites of scutellarin in rat p las ma by HP LCJ.JPhar m B i omed Anal,2006,40(2:465.4Zhong D F,YangB H,Chen X Y,et al.Deter m inati on of scutel

23、2larin in rat p las ma by high2perf or mance liquid chr omat ographywith ultravi olet detecti onJ.J Chr omat ogr B,2003,796(2:439.5张海燕,平其能,郭健新,等.灯盏花素及其2环糊精包合物在大鼠体内的药代动力学J.药学学报,2005,40(6:563. 6居文政,张军,谈恒山,等.高效液相2质谱联用法(HP LC2MS测定灯盏乙素血药浓度及其临床药代动力学研究J.中国临床药理学与治疗学杂志,2005,10(3:298.7刘奕明,林爱华,陈汇,等.灯盏花素在小鼠体内药物

24、动力学研究J.中国临床药理学与治疗学,2005,10(3:310.8L i N,Hang J M,W eng W Y,et al.Deter m inati on of scutellarinin rabbit p las ma after oral adm inistrati on by HP LC2MS with s olid2phase extracti onJ.J Chin Phar maceut Sci,2005,14(1:38. 9杨强,杨俊毅,李思成,等.灯盏花素缓释片在Beagle犬体内相对生物利用度的研究J.华西药学杂志,2004,19(3:175.10Lv W L,Guo

25、J X,J in L,et al.D istributi on of li pos omal brevis2cap ine in brain foll owing intravenous injecti on in ratsJ.I nt JPhar m,2005,306(122:99.11韩伯军,邵荣,高志强.灯盏花素注射液治疗脑梗死83例疗效观察J.中国临床药学杂志,2000,9(6:371.Phar macok i n eti c and tissue d istr i buti on study of scutell ar i n i n ra tsY OU Hai2sheng1,DON

26、G Ya2lin1,X I N G J ian2Feng2,ZHANG Chun2ling3,WANG M ao2yi1(1.D epart m ent of Phar m acy,The First A ffiliated Hospital of M edical School,X ian J iaotong U niversity,X ian710061,China;2.X ian J iaotong U niversity of M edical School,X ian710061,China;3.Red C ross Hospital,X ian710061,ChinaAbstrac

27、tO bjecti ve:To investigate the phar macokinetic and distributi on character of scutellarin in p las ma and tissues in rats,in order t o p r ovide s ome references f or rati onal drug use in the clinic.M ethod:The s oluti on of scutellarin was ad m inistered t o rats(80mgkg-1by oral gavage.A high pe

28、rf or mance liquid chr omat ography method deter m inated the scutellarin concentrati on in rat p las ma and tissue.The p las ma sa mp les were perfor med by s olid phase extracti on method.The other bi ol ogical samp les were extrac2 ted by ethyl acetate.Result:The range of scutellarin in p las ma

29、and tissue in rats were101280ngmL-1(R2>0199,40 1280ngg-1(R2>0199,res pectively.The l owest detecti on of scutellarin were10ngmL-1and40ngg-1,the p recisi on were1961less than 8%1The main phar macokinetic parameters of scutellarin were as foll ows:t max ,C max ,AUC and MRT being (717±019h,(

30、28810±7512g L -1,(516±116g mL -1h -1,(1715±114h -1,res pectively .Conclusi on:These methods app liedthe study of phar macokinetics of scutellarin .After oral the scutellarin in rats,the concentrati on 2ti m e course doesn t obey any compart 2ment model .The concentrati on 2ti m e curv

31、e is the double peaks .Key wordsscutellarin;HP LC;phar macokinetics;distributi on of tissue责任编辑古云侠桂皮醛对N I H3T3细胞周期及相关蛋白表达的影响赵京霞,李萍3,盛巡,刘欣,梁代英(北京市中医研究所首都医科大学附属北京中医医院,北京100010摘要目的:观察肉桂主要成分桂皮醛对小鼠成纤维瘤细胞株N I H3T3细胞周期及相关蛋白的影响。方法:采用流式细胞仪检测桂皮醛(515ng mL -1对N I H3T3细胞周期分布的影响;用免疫细胞化学法检测桂皮醛对N I H3T3细胞的细胞周期蛋白D1(Cyclin D1和增殖细胞核抗原(PCNA 蛋白表达的影响。结果:流式细胞仪检测显示,桂皮醛作用24h 后N I H3T3细胞S 期比例上升了3%(P <0105,G 2/M 期比例无明显升高,细胞增殖指数(PrI 增加了315%(P <0101。经桂皮醛刺激后,N I H3T3细胞Cyclin D1和PCNA 蛋白表达量明显增加,与对照组比较,有极显著差异(P <0101。结论:桂皮醛可推动N I H3T3细胞周期向前进展,这种正向调控作用与桂皮醛能促进Cyclin D1和PCNA 蛋白表达有关。关键词桂皮