Westernblot操作流程

1、.1张张 蕾蕾.2Western blot的原理的原理 利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过利用抗原抗体的免疫反应，先将蛋白通过SDS-PAGE电泳分离开来，然后再利用电场力的作电泳分离开来，然后再利用电场力的作用将胶上的蛋白转移到固相载体（用将胶上的蛋白转移到固相载体（NC膜或膜或PVDF膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复膜）上，然后再加抗体形成抗原抗体复合物，利用增强化学发光法或生色底物呈色反合物，利用增强化学发光法或生色底物呈色反应将结果显示到膜或底片上。从而对目的蛋白应将结果显示到膜或底片上。从而对目的蛋白进行定性和半定量分析的一种检测蛋白的方法进行定性和半定量分析的一种检测蛋白的方法

2、 .3样本制备显影孵育抗体电泳分离电转印迹.4培养细胞总蛋白的提取培养细胞总蛋白的提取收集细胞收集细胞 ：2000rpm/min，5min后弃上清后弃上清加加PBS 洗一次，洗一次，2000rpm/min ，5min加入加入200-600 ul RIPA混匀（液体清澈透明），后置混匀（液体清澈透明），后置于冰上于冰上10-30min100,10min后置于冰上冷却后置于冰上冷却15000rpm/min, 5min 后取上清，分装后后取上清，分装后-20 保存保存 组织中总蛋白的提取组织中总蛋白的提取0.1g加入加入0.8ml RIPA（强）裂解液（强）裂解液用干净的剪刀将组织块尽量剪碎后匀浆用

3、干净的剪刀将组织块尽量剪碎后匀浆.5考马斯亮兰染色法考马斯亮兰染色法(CBB法，法，Bradford法法)原理：考马斯亮蓝原理：考马斯亮蓝(CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质色色素结合物在素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。BCA(二喹啉甲酸二喹啉甲

4、酸)法法原理：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一原理：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的价铜离子，一价铜离子和独特的BCASolutionA（含有（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。根据吸光值可以推

5、算出蛋白浓度。蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定.6操作步骤：操作步骤：绘制标准曲线（绘制标准曲线（BSA标准品：标准品：0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/ml）蛋白样品吸光度值测定蛋白样品吸光度值测定蛋白浓度计算蛋白浓度计算蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定.7电泳分离电泳分离 浓缩效应浓缩效应 电荷效应电荷效应 分子筛效应分子筛效应三大效应：三大效应：.8电转印迹电转印迹湿转法湿转法半干转移法半干转移法带手套操作带手套操作转膜时间：根据分子量的大小决定转膜时间：根据分子量的大小决定.9电转印迹电转印迹根据目的蛋白分子量的大小选择分离胶的浓度根据目的蛋白分子量的大小选择

6、分离胶的浓度.10电转印迹电转印迹凝胶对应负极凝胶对应负极, 膜对应正极膜对应正极 .11膜的选择膜的选择.12 要得到有意义的结果，抗体必须只结合目标蛋白要得到有意义的结果，抗体必须只结合目标蛋白而不与膜结合，用惰性蛋白或非离子去污剂封闭而不与膜结合，用惰性蛋白或非离子去污剂封闭膜上的结合位点可以降低抗体的非特异性结合膜上的结合位点可以降低抗体的非特异性结合, 封封闭剂与膜的亲和力应大于抗体。它应该封闭所有闭剂与膜的亲和力应大于抗体。它应该封闭所有的未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶的未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位、也不与抗体或检测试剂有交叉反应。蛋白的表位、也不与

7、抗体或检测试剂有交叉反应。 做到磷酸化项目时，就不能用牛奶了，要用做到磷酸化项目时，就不能用牛奶了，要用BSA，因为牛奶里含有一些磷酸化酶。因为牛奶里含有一些磷酸化酶。封闭封闭.13 用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗抗原抗体复合物体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。白质的位置上结合着一抗。 处理过的印迹进一步

8、用适当标记的二抗处理，二处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有的抗体。处理后，带有标记的二抗标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。即是待研究的蛋白质的位置。 .14 抗体的选择抗体的选择.15l印迹用酶联二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，印迹用酶联二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会出现可见当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会出现可见的

9、区带，即指示目的蛋白的位置的区带，即指示目的蛋白的位置l酶联的二抗：酶联的二抗： 辣根过氧化物酶体系辣根过氧化物酶体系(HRP)：DAB显色或化学发光试显色或化学发光试剂显影（剂显影（ECL） 碱性磷酸酶体系碱性磷酸酶体系(AP)： BCIP+NBT显色显色ECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗上标记的过氧化物酶或辣根过氧化物酶，在上标记的过氧化物酶或辣根过氧化物酶，在H2O2的存在下，使底物的存在下，使底物(化学发光物质鲁米那化学发光物质鲁米那)发生氧化还原反应，从而发出荧光。发生氧化还原反应，从而发出荧光。.16.17 内参内参即是内部参照（即是内部

10、参照（Internal Control），对于哺），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达由管家基因编码表达的蛋白的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。以校正蛋白质定量、上样化时常用它来做参照物。以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。.18提取蛋白，测定含量提取蛋白，测定含量SDS-PAGE转膜转膜封闭封闭一抗结合一抗结合NC膜：水膜：水10min5%的脱脂奶粉的脱脂奶粉in PBS-T or TBS-T，RT，1h PBS-T或或TBS-T稀释，稀释，37 ,1 h或或4 过夜过夜 30-100ug.19HRP-二抗结合二抗结合洗膜洗膜ECL发光试剂作用发光试剂作