巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌

1、巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程 菌Expression Optimization of Heterologous Protein inPichia pastoris by Disrupting PEP4 GeneYANG Yang 1, ZHAO Jian1*, SHI Jun 2(1. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; 2. Model Organism Research

2、Center, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Shanghai 200031, China)：Objective To create protease-deficient mutants for improving productivity and secretion efficiency of heterologous protein expression. Methods PEP4 gene of Pichia pastoris was disrupted by transforming with pRS306/PEP4 L&am

3、p;R vector. Effects of the resultant PEP4 strain on heterologous protein expression were then measured by practical expression compared with the wild strain. Results By disrupting the PEP4 gene in Pichia pastoris, the productivity of heterologous protein expression increased 9.5% on average. Conclus

4、ion Disruption of PEP4gene in Pichia pastoris is an effective method for controlling proteolytic degradation of heterologous protein MIP.巴斯德毕赤酵母( Pichia pastoris )是较理想的外源基因 表达系统 1 。在外源蛋白质的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的 胞内和胞外均有一定量蛋白酶的表达。 因此， 不论是胞内表达还 是分泌表达， 大多数外源蛋白质均可能被降解， 这是影响蛋白质 表达量的重要因素，也增加了目的蛋白质纯化的难度。近年，蛋 白酶成为 P

5、. pastoris 表达系统研究的热点，越来越多的蛋白酶 的遗传背景和生理生化性质得到深入的研究 2,3 。研究还表明， P. pastoris 能根据细胞生长环境调整自身酶系，以合成或降解 不同的蛋白质和细胞器。液泡是蛋白质降解的最主要场所 3 ， 另一降解场所是细胞基质蛋白酶体。为防止基因工程表达的蛋白质被降解， 目前较流行的是构建 蛋白酶缺失菌株 4 ，以提高产量及外源蛋白质表达的分泌率。 一种完全缺乏蛋白酶的菌株需要剔除每个编码液泡蛋白酶的不 同基因。幸运的是，有一种方法仅用一步即可消除大部分蛋白酶。 液泡蛋白酶首先以无活性的酶原形式合成， 然后在液泡中经蛋白 质水解作用去除前肽变为

6、活性肽。主要的蛋白质水解酶 - 蛋白酶 A由基因PEP4编码，剔除PEP4就可阻止所有其他蛋白酶变为活 性肽，这种方法的复杂性在于蛋白质水解酶 B 也能分解前肽从而 激活液泡蛋白酶。在缺乏蛋白质水解酶 A的情况下，有活性的蛋 白质水解酶B仍能在几个细胞生长周期内继续激活液泡蛋白酶， 但蛋白质水解酶 B 的自我激活能力并不是无限的， 一旦其活性降 低到某一临界值以下，细胞就会不可逆地转变为无蛋白酶细胞。剔除PEP4之后，再将破坏了 PEP4的菌株连续几代划线分离单菌 落以稀释蛋白质水解酶 B,从而最终获得无蛋白酶活性菌株。通 过鉴定羧肽酶Y的活性即可证明PEP4基因是否被剔除。我们已经成功地构建

7、了能分泌外源蛋白 MIP 5 的巴斯德毕 赤酵母，在此基础上，本研究通过构建质粒 pRS306/PEP4L&R置 换巴斯德毕赤酵母中的 PEP4基因，并将剔除PEP4菌株的外源蛋 白质表达产物MIP的表达量与原菌株比较。1 材料1.1 菌株和质粒毕赤酵母 GS115/MIP菌株BL-21(DE3)以及DH5x均系本实 验室保存；质粒 pRS3066 系中科院上海生化所周金秋老师实验 室收藏。1.2 培养基(1) LB培养基(g/L ):酵母抽提物5 ,氯化钠10,胰化 蛋白胨10 ; (2) YPD培养基(g/L ):酵母抽提物10 ,蛋白胨 20,葡萄糖20 ; (3) YP培养基(

8、g/L):酵母抽提物10,蛋白 胨 20 ； (4) SD 培养基( g/L ):去氨基酸的酵母氮碱 6.7 ，葡 萄糖 20 ,琼脂 20 ；( 5)SC-ura 培养基( g/L ):去氨基酸的 酵母氮碱 6.7,葡萄糖 20,琼脂 20,省却 Ura 的混合物 2；(6) 5-FOA固体培养基(g/L ):去氨基酸的酵母氮碱6.7，葡萄糖20 ,5-FOA 1，尿嘧啶 0.05 ，琼脂 20 。1.3 试剂限制性核酸内切酶 Sall , Xhol , Notl , SmaI, EcoRI 及 T4 DNA连接酶等（TaKaRa公司）；DNA凝胶抽提试剂盒（博亚生物试 剂公司）。2方法实验

9、操作过程见图 1。2.1 构建质粒 pRS306/PEP4 L&R2.1.1酵母染色体的抽提和质粒 pRS306的扩增 按照酵母染 色体DNA的分离方法7分离毕赤酵母 GS115/MIP的染色体DNA 按质粒扩增法8用大肠杆菌扩增质粒 pRS306并用碱法提取。2.1.2 引物设计与合成根据引物设计原则，设计左、右臂引 物，序列如下：左臂引物（131333 bp ）:primer1: 5'GATGTCGACCCTTTCTTTATCTGTAACTC TGTCG 3' primer2: 5'GCACTCGAGTGTATCTTAGCAGAATGAAC TTTGG 3&

10、#39; 右臂引物（ 1 5781 782 bp ）：primer3:5'GATGCGGCCGCCATCTTCAGTACGTGATTGC TTGTC 3'primer4: 5'GCACCCGGGTACCTTTAGTTACCAACCGC ATAGA 3' 2.1.3PCR扩增左右臂 DNA片段PCRT增221 bp的毕赤酵母 PEP4左臂 DNA片段和225 bp的右臂片段：在 La Taq 50卩L体系下，以毕赤酵母基因组 DNA为模板，按TaKaRa Kit说明书进 行2次PCF后，1.5%琼脂糖凝胶电泳分离产物，再用DNA凝胶回收试剂盒回收得左、右臂(L-a

11、rm，R-arm)DNA片段，最后用1.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 DNA片断大小并对DNA测序。2.1.4 酶切与连接L-arm，R-arm DNA片段与pRS306的酶切 与连接： 在20卩L酶切体系，37 C条件下，用SalI , Xhol分 别双酶切左臂DNA与质粒pRS306后回收DNA片段，再用T4 DNA 连接酶于16 C水浴连接9 h后，得质粒pRS306/PEP4L转化大 肠杆菌，扩增质粒 PRS306/PEP4L用PCF鉴定左臂DNA片段是 否接入质粒，并对DNA测序。在20卩L酶切体系，37 C条件下，用Notl, SmaI分别双酶 切右臂DNA与 pRS306/PEP4L

12、后回收DNA片段，再用T4 DNA连接 酶于16 C水浴连接9 h后得质粒pRS306/PEP4L&R通过转化大 肠杆菌中扩增质粒pRS306/PEP4 L&R用PCR鉴定右臂DNA片断 是否接入质粒，并对 DNA测序。2.2用5-FOA平板筛选ura突变菌株7将巴斯德毕赤酵母(GS115/MIP)大约5X 107个细胞涂布于 5-FOA平板。于30 C培养56 d，将长出的克隆转移到 YPD平 板上。用5-FOA平板筛选2轮后，将长出的克隆分别涂布到 SD SD+ura平板测试表型，SD板上不生长，SD+ura板上生长者即为 突变菌株。2.3 毕赤酵母的高效转化及检测20卩L

13、酶切体系在37C条件下，用EcoRI酶切质粒 pRS306/PEP4 L&R 2h后回收 4.8 kbp DNA 片段并通过 0.7%琼 脂糖凝胶电泳进行鉴定。按照酵母的高效转化方法9将毕赤酵母GS115/MIP与质粒 pRS306/PEP4L&R进行转化，涂 SC-ura平板，挑取单克隆在 YPD 培养基上连续几代划线，分离单菌落，并对该菌的染色体 DNA进 行PCF检测，根据DNA片段大小判定毕赤酵母PEP4基因是否剔 除（置换前片段约为 1.7 kbp ，置换后片段约为 4.8 kbp ），并 对PCRT增得到的DNA片段测序。将单菌落摇瓶培养后，按照羧肽酶 Y平板检测法

14、10鉴定 CPY舌性。注意辨别菌落之间颜色的差异。2.4甲醇诱导后表达产物 MIP的比较随机挑取PEP4基因剔除前后毕赤酵母单菌落各 7个，接入50 mL YPD培养基，30 C, 130 r/min 条件下摇床培养 2 d，当 A600nm至1015时，取1 mL留作上样用，其余菌液无菌条件下 以3 000 r/min 离心8 min,弃上清，加入新鲜的 YP培养液50 mL, 连续4 d加入1%体积比的甲醇（即0.5 mL ）诱导表达。菌液以3 000 r/min离心8 min，取200卩L上清液，冻干后溶于 20卩L 水用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表达量。 进行 7 组对照实验， 按电 泳条

15、带亮度比较PEP4基因剔除前后毕赤酵母 MIP的表达量，并 统计实验结果。3 结果与讨论3.1 构件质粒 pRS306/PEP4 L&R3.1.1PCR扩增DNA片段的鉴定PCRT增221 bp毕赤酵母 PEP4基因左臂和225 bp右臂DNA片段后进行琼脂糖凝胶电泳鉴 定，表明其大小与预期一致，结果见图2。测序结果表明， PCR扩增后DNA片段的序列与已知序列完全一致。3.1.2左、右臂DNA片段与质粒pRS306分别连接后鉴定T4 DNA连接酶连接后，进行 PCR（分别以primerl ，primer2和 primer3 ， primer4 为引物）并用电泳鉴定，结果与预期一致，

16、见图 3、图 4。测序结果也表明左右臂均顺利地接入质粒pRS306。3.2 毕赤酵母的高效转化及检测用EcoRI酶切质粒pRS306/PEP4 L&R由电泳结果可见，酶 切后呈现单一条带，酶切完全，见图 5。转化后在 SC-ura 平板 上得到期望的转化子。PCF检测结果表明，置换前片段约为 1.7 kb，置换后片段约为4.8 kb，达到预期结果，见图 6。基因剔除前片段约为 1.7 kbp ，置换后片段约为 4.8 kbp 。Marker:入-Hind 山 digest通过鉴定羧肽酶Y的活性即可证明PEP4基因是否剔除。野 生型菌株将显红色，羧肽酶Y无活性菌株则显黄色。实验结果表 明，原毕赤酵母菌落呈红色；基因剔除后毕赤酵母菌落呈黄色， 即PEP4基因已经完全剔除，见图 7。左图为原毕赤酵母