献给初学者western blot操作步骤详解上

1、献给初学者：western blot 操作步骤详解（上）2016-08-08 dlzhangyu 生物学霸我做 western 的时候，发现目前的资都很，网上的资也大多互相传抄，说法各异，于是综合目前网上所能找到的资和个人实际经验，编辑这份 western blot 操作步骤，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献。我按下文的步骤操作已经做出来 可重复的、背景干净的 western 条带，所以相信你也。为节省时间，我总结一下 western blot Quick Guide和一天做出 western 的具体时间规划，附在文末，要在下一次展示。蛋白质印迹的发明者是大学 Ge

2、orge Stark。Neal Burnette 于 1981 所著的 Analytical Biochemistry 中首次被称为 Western Blot。最开始做印迹的是一个叫 Southern 的科学家，但印迹的对象是 DNA 链，他把这种技术称为 Southern blot，后来出现两个过程相似，但是对象同的印迹方法，一个 RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为 Northern 和Western，与这两个技术的发明人没有 。由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品 是 Western Blotting 的第一步，样品 是关键步骤，要求尽可能的获得

3、所有蛋白质，应注意以下问题：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其 形成一个各自多肽的溶液。尽去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。防止蛋白质在样品处过程中的人为的修饰， 过程应在低温下进，以避免细胞破碎出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。样品建议分装成合适的（比如分装出 20 ul 检测蛋白质定用），然后于 -20 或 -80 中长期保存，但要注意要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。若蛋白提取过程 问题或蛋白发生降解则很难进好之后的实验，也就很难做出 结果一、蛋白质的样品背景。除此之

4、外 loading buffer 的作用也容忽视，切莫使用新鲜的上样缓冲液，同时在处时也应注意将样品与 loading buffer 混合均匀。如果要定的话，一般选择 BCA 或者 Bradford 方法， BCA 要求检测波长为 562 nm， Bradford 为 595 nm。具体方法见各试剂盒说明书。为避免假阳性结果，建议先把 lysis buffer 加入 BCA 工作液或考马 G250 混合看是否产生颜色。测 白含后，计算含 50100 ug 蛋白的溶液体积即为上样（一般 8 cm 宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质为 150 ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样宜过大）。网上有

5、人喜欢等质上样（即每个泳道的上样体积一但质一定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质上样，计算上样体积时需包含loading buffer 的体积）。按分子克的说法，还是使用等体积上样比较好。上样总体积一般超过 15 ul，加样孔的最大限度可加 20 ul 样品。上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用 灯加热至沸腾，在沸水中煮 35 min 使蛋白充分变性。也可以使用 PCR 仪 95°加热 5 min，效果佳，操作方。之后样品可以在 4 冰箱短时间保存，也可在 -20 冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。1.板蘸点洗洁精轻轻

6、擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐晾干。若继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来， 板之间垫 纸隔开。梳子应用水洗干净，临用前用无水乙醇擦拭晾干。2. 灌胶与上样 板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作前先往 板间灌水，检查是否）。 按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入TEMED，之后摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试三、SDS-PAGE 电泳二、蛋白质定剂的新鲜，特别是过硫酸铵。灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固 后胶体积缩小越多）。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的快（灌胶 时开始可快一些

7、，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿 板流下，这样胶中才 有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。梳子插入浓 缩胶时，应确保没有气泡。注意给积层胶出足够的空间（分子克推 荐长度为插入的梳齿长再加 1 cm）。 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝。再等几分钟觉得差多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。聚合时间由 AP 以及 TEMED 决定，通常在 30 min 左右，AP 新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加 AP 以及 TEMED 的 ，但通常 超过 1 h，若超过 1 h 甚至长仍未

8、聚合，应检查配制的操作有无错误。由于 TEMED 催化 APS相关化学基团，再由 APS的基团催化Acr/Bis 聚合，所以如果 APS 新鲜的话加再多的 TEMED 效果也佳，这就是为么推荐 APS 每周新鲜配置的 。 按说明书配积层胶，加入 TEMED 后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿 板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在 浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。待到浓缩胶凝固后，两手分 别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。 趁积层胶聚合的这段时间，取适当体积样本混

9、合 1X SDS loading buffer（最好事前分装好，每次从冰箱取一管即可），95100° 加热5 min，若有沉淀可用稍低温度，比如 4555° 加热 1 h 达到变性的目的。我一般习惯分装 20 ul 到 PCR 管，先和 loading buffer 混合好， 临用前用 PCR 仪加热 95 °C 5 min，效果错。 胶做好后连同板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后开始准备上样（我们使用的是大连竞迈科技公司的 MV-III 型小型单垂直板电泳槽，电泳液至少要漫过内测的小板，电泳槽下面用倒太多电泳液）。加样前可用 5 ml 注射或加样先冲洗一下加

10、样孔。用微加样贴壁吸取样品，将样品吸出要吸进气泡。将加样针头插至加 样缓慢加入样品（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能 使样品溢出。加入下一个样品时，进样需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3次，以免交叉污染。目前我们做的 mini 胶上有 10 个上样孔，一般在第一个入marker（是 Fermentas 预染 marker），其余 9 个入样品， 也可在头尾加入 marker，中间 8 个样品。加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。在未加样的应加入等的样品缓冲液。上样时，小心要使样品溢出而污染相临加样孔。也可使用 10 ul的枪头就，比用微加样快很多，用枪头时注意要插得太深，容 把板撑

11、开，样品就落到胶和板之间的空隙。3. 电泳电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯 酰胺，网上有资建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏 通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通，但是在分子克上却反对这种做法，由是会破坏缓冲系统 pH 的连续性。请各位按照实际经验来做即可。电泳时间和电压说法各异。按照各实验室的惯或者电泳槽的使用说明来操作。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进转膜。为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进电泳，电泳结束后也应直接或者转印。就讲到这儿，欲知后事如何，且听下回分解。文章来源：丁香园站友 dlzhangyu图片来源：网络阅读原文 阅读 26402

12、138精选言陈陈正好在用这个实验技术，说很多以前我没注意到的细节问题，感谢作者和小编。20168月8日19作者回复分享出去就是对我们和作者最大的支持哦20168月8日4C'est la vie最近板就让我学习做这个，看到推送真的是好感动(_)感谢大神的总结20168月8日11作者回复分享和点赞就是对我们最大的支持哦20168月8日三蛋官人,继续嘛,人家等及20168月8日8作者回复客官急，周四见。20168月8日18陈俊明请教楼主，如果10个上样孔。我只加8个样品。剩下两个孔没有添加等的上样缓冲液。对蛋白在凝胶上的分布有影响吗？请多多指教20168月8日M. 总结的真用心，期待下部6生

13、物学霸精品公开课正式上线啦，点击下方阅读原文查看具体课程。20168月8日作者回复好类，感谢支持哦20168月8日1甘支持，学到很多，请继续20168月8日3麦霸样品怎么可能反复冻融？这个科学啊20168月8日3作者回复这个可以做到哦20168月8日3糖果 TD 赶紧出下部吧20168月8日作者回复别急哈 20168月8日稻草这个写得太好20168月8日2作者回复对你们有帮助真是太好啦20168月8日1培雁2现在是 WB自动化定的仪吗？感觉那个仪的重复性，灵度比较高，而且效率挺高的。20168月8日2啦最近我们 经常在跑电泳的时候液，知道作者遇到过没有好苦恼20168月8日毛阿懋哇咔咔这是我写

14、的啊 没想到这么多 看到能帮助这么多人我心很高兴20168月8日2作者回复非常感谢你20168月8日Iris要 ing2赞赞赞。多谢小编20168月8日作者回复多写作者哦20168月8日2于芳芳新学期 板让做这个实验20168月8日作者回复加油哦，好好做20168月8日柚子学霸可否请你帮我解个惑呐？ 我最近配胶拔出梳子后加样儿都好好洗呢，你帮我分析分析吧，拜托啦！20168月9日1变得弯弯扭扭的哪哪作者回复要么胶有问题，要么凝固时间够20168月10日1翠平太棒！20168月8日1作者回复感谢支持哦20168月8日米昨天才看到师兄做这个实验，还想哪20168月8日1查查呢，结果 就发，真是心有

15、灵犀文刀家的禾方好巧，过两天就要做印迹呢,正好可以结合BIO-RAD的使用手册一块儿看， 谢小编20168月8日1作者，谢廖大胖正需要，感谢作者20168月8日1小小韩期待下部 正做着呢20168月8日1小小鱼太感谢，对科研一窍通的我，可以一步一步解科研，好开心2月21日Valie-霍我做的蛋白是20kDa的，先用IPTG诱导检测，跑SDS-PAGE和未诱导的比效果好1月21日pilgrimage煮 白后，蛋白变性沉淀，这个时候上清液的蛋白浓度会下降，知作者考虑这个问 题没？201611月29日明样品加入loading后，如果暂时跑胶，可以先加热变形直接-20保存吗201611月15日天对我这样的初学者来说，这样的文真的多多益善赞!20168月10日小编！下篇！快快快快快20168月8日电泳时上层胶和下层胶电压是是必须一样呢？我们上层是80V，下层是120V20168月8日柚子看来我得等到下篇出再开工大大的赞一个！20168月8日作者回复很快就出来哈20168月8日louis也正在为此发愁，感谢作者和小编！20168月8日请赶快新,下篇20168月8日作者回复20168月8日且走且看最近也在做这个，但是木有结果2016