一种快速有效的细菌鉴定方法

1、一种快速有效的细菌鉴定方法一种快速有效的细菌鉴定方法 传统的细菌鉴定方法是根据微生物的细胞形态、生传统的细菌鉴定方法是根据微生物的细胞形态、生理生化特征、血清学反应、噬菌体敏感性等多方面理生化特征、血清学反应、噬菌体敏感性等多方面进行综合鉴定的，使用该方法进行鉴定的依据为细进行综合鉴定的，使用该方法进行鉴定的依据为细胞的表形特征，其缺点是检测项目多、工作量大、胞的表形特征，其缺点是检测项目多、工作量大、耗时、结果不稳定等，易出现弱反应或假阳性。耗时、结果不稳定等，易出现弱反应或假阳性。 现代的方法：利用了现代的方法：利用了PCR的方法，根据的方法，根据16s rDNA两端的保守序列，设计引物两

2、端的保守序列，设计引物PCR扩增未知细菌的扩增未知细菌的16s rRNA基因，然后对基因，然后对PCR扩增的扩增的DNA片段进行片段进行序列分析，经与序列分析，经与GenBank中的已知序列进行同源性中的已知序列进行同源性比较后，对未知菌种进行鉴定。该方法是在分子水比较后，对未知菌种进行鉴定。该方法是在分子水平上对细菌进行的分类，具有快速、准确、重复性平上对细菌进行的分类，具有快速、准确、重复性好等优点。好等优点。鉴定的原理鉴定的原理 细菌的细菌的rRNA是细胞内含量最多的是细胞内含量最多的RNA，约占总量的，约占总量的80%以上，其分子量大，种类多，由高度保守区和以上，其分子量大，种类多，由

3、高度保守区和可变区组成。细菌的可变区组成。细菌的rRNA包括包括5S、16S、23S，其中，其中5S rRNA信息量少，不适合分析；信息量少，不适合分析；23S rRNA分子大，分子大，信息量多，但碱基突变速度较快，同样不适于细菌信息量多，但碱基突变速度较快，同样不适于细菌鉴定；相比之下鉴定；相比之下16S rRNA的遗传较为稳定，长度在的遗传较为稳定，长度在1550200bp左右左右,代表信息量适中，是研究系统进代表信息量适中，是研究系统进化的好材料。目前已报道了化的好材料。目前已报道了10000种以上的细菌种以上的细菌16S rDNA序列，通过对序列，通过对16S rDNA序列分析，可以将

4、细序列分析，可以将细菌划分到属或种，对于难以培养的细菌、生化反应菌划分到属或种，对于难以培养的细菌、生化反应不明显及传统表型方法不能鉴定的细菌，使用该法不明显及传统表型方法不能鉴定的细菌，使用该法鉴定细菌尤为方便。鉴定细菌尤为方便。 本文以某食品公司的食品原料和加工后成品中的本文以某食品公司的食品原料和加工后成品中的细菌检测为例，简述细菌鉴定的方法。细菌检测为例，简述细菌鉴定的方法。1.细菌分离及基因组细菌分离及基因组DNA的制备的制备 细菌分离：细菌分离：使用平板记数的方法对食品原料及加使用平板记数的方法对食品原料及加工后成品中的细菌进行分离。工后成品中的细菌进行分离。 基因组基因组DNA的

5、制备：的制备：从食品原料的琼脂平板上挑从食品原料的琼脂平板上挑出出10个单菌落（分别编号个单菌落（分别编号1-10），从加工后成品），从加工后成品的琼脂平板上挑出的琼脂平板上挑出7个单菌落（编号个单菌落（编号11-17 ），采），采用细菌少量提取基因组用细菌少量提取基因组DNA试剂盒提取各个样品试剂盒提取各个样品的基因组的基因组DNA。2. PCR扩增扩增2.1 按下述组分配制按下述组分配制PCR反应液反应液 模板模板*： 1l PCR Premix 25 l Forward Primer 0.5 l Reverse Primer 0.5 l 16S-free H2O up to 50l *阴

6、性对照使用阴性对照使用1 l的的16S-free H2O替代模板替代模板DNA 阳性对照使用阳性对照使用1 l的的Positive Control DNA为模板为模板 2.2 PCR反应条件如下：反应条件如下： 94 5min 5min 94 1min 94 1min 50 1min 30cycles 50 1min 30cycles 72 1.5min 72 1.5min 72 5min 72 5min3 琼脂糖凝琼脂糖凝 胶电泳胶电泳 使用使用1%的琼脂的琼脂糖进行电泳，结糖进行电泳，结果如下。电泳结果如下。电泳结果显示，从食品果显示，从食品原料和加工后成原料和加工后成品中的品中的17个细

7、菌个细菌中，均扩增出了中，均扩增出了16SrDNA的的DNA条带。条带。11-17 成品中分离细菌的成品中分离细菌的16SrDNA PCR扩增结果扩增结果 阴性对照（以阴性对照（以16S-free H20为模板）为模板）+ 阳性对照（以阳性对照（以Positive Control DNA为模板）为模板）1-10 原料中分离细菌的原料中分离细菌的16S rDNA PCR扩增结果扩增结果 阴性对照（以阴性对照（以16S-free H20为模板）为模板）+ 阳性对照（以阳性对照（以Positive Control DNA为模板）为模板）4 PCR产物的琼脂糖凝胶回收产物的琼脂糖凝胶回收 使用使用Ag

8、arose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 对对PCR扩增的产物进行了切胶回收，扩增的产物进行了切胶回收，纯化目的片段。纯化目的片段。5 DNA测序测序 对切胶回收纯化的各对切胶回收纯化的各PCR扩增产物使用扩增产物使用Seq forward, Seq internal, Seq reverse 三条引物三条引物进行测序。进行测序。 结果比对结果比对 将各细菌将各细菌DNA的测序结果通过的测序结果通过GenBank（NCBI）进行了比对，根）进行了比对，根据同源性的对比鉴定了相应的细菌。据同源性的对比鉴定了相应的细菌。 AJ 288151 Pseudomona

9、s stutzeri 1366 100% AY360594 Bacilli bacterium 1088 96%. 结果分析：结果分析： 细菌的细菌的16SrDNA序列对比结果表明：在食品原料序列对比结果表明：在食品原料中含有的细菌种类比较多，共有中含有的细菌种类比较多，共有9种；但灭菌后的种；但灭菌后的食品中只含有食品中只含有3种，主要是芽孢细菌。通过菌种鉴种，主要是芽孢细菌。通过菌种鉴定发现，成品中出现的芽孢菌从原料中并没有检定发现，成品中出现的芽孢菌从原料中并没有检测出来，可能的原因是：此种细菌在原料中并不测出来，可能的原因是：此种细菌在原料中并不是主要的菌群，经过高温灭菌后其他菌体死亡

10、，是主要的菌群，经过高温灭菌后其他菌体死亡，而此种细菌并没有被完全杀死，发展成了主要细而此种细菌并没有被完全杀死，发展成了主要细菌。因此可以推断：食品的污染可能是灭菌不彻菌。因此可以推断：食品的污染可能是灭菌不彻底造成的。特别是芽孢细菌，一般比较耐热，高底造成的。特别是芽孢细菌，一般比较耐热，高温高压只能杀死菌体，对于菌体产生的芽孢休眠温高压只能杀死菌体，对于菌体产生的芽孢休眠体可能未能杀死，造成食品污染。体可能未能杀死，造成食品污染。 解决方案：解决方案： 根据以上的结果分析：建议采用如下方法对食品原根据以上的结果分析：建议采用如下方法对食品原料和成品进行处理：料和成品进行处理：1、减少食品的包装，不改变原有的灭菌条件，以免、减少食品的包装，不改变原有的灭菌条件，以免破坏食品风味。破坏食品风味。2、对食品原料采用两次灭菌的方法。第一次灭菌将、对食品原料采用两次灭菌的方法。第一次灭菌将菌体杀死，然后到休眠芽胞萌发成菌体后，进行二菌体杀死，然后到休眠芽胞萌发成菌体后，