一个新的水稻卷叶突变体rl9(t)的遗传分析和基因定位概要

1、论文第50卷第24期2005年12月一个新的水稻卷叶突变体rl9(t的遗传分析和基因定位严长杰*严松*张正球梁国华陆驹飞顾铭洪？(扬州大学江苏省植物功能基因组学重点实验室，江苏省作物遗传生理重点实验 室,扬州225009.* 同等贡献.？联系人，E-mail: yichuan摘要对水稻中调控形态发育的基因进行发掘和研究是进行水稻株型改良和植物 生长发育分子生物学研究的重要基础研究工作.本研究在粳稻中花11中鉴别了一个 新的卷叶突变体，并对其进行了遗传分析和基因定位.结果表明，该卷叶突变体是由 一隐性单位点(rl9(t控制,利用SSR标记已经把Rl9(t定位在水稻第9染色体上.利用 已经公布的水

2、稻基因组序列,在Rl9(t附近区域发展了 30个新的STS标记,对Rl9(t 进行了精细定位.以此为基础,构建了覆盖Rl9(t区域的PAC重叠群，并把目标基因 定位在一个约42 kb的区段上，为最终克隆目标基因奠定了基础.关键词水稻(Oryza sativa L卷叶基因分子标记物理图谱水稻叶片是光合作用的重要场所，也是株型构成的重要因素.在高产育种及株型 改良中，叶片性状一直是水稻遗传育种家关注的焦点1.研究表明，叶片适度卷曲有 利于保持叶片直立，改善水稻生长中后期群体基部的受光条件，提高光能利用效率， 从而有利于水稻产量的提高26.水稻是一多型性作物，存在丰富的品种类型，叶片的变异也极其多样

3、.从卷曲方 向看,有正卷的(叶片两侧沿中脉向内卷曲,也有反卷的(叶片两侧沿中脉向外卷曲； 从同一植株不同叶位看，有全株叶片卷曲，也有部分叶片卷曲的；从卷曲程度看，有 高度卷曲成筒状的，也有中度卷曲和微卷的.因此利用不同的卷叶材料，分析控制叶 片生长发育的基因及其分子调控机理，对研究植物叶片发育的分子生物学具有重要 的理论意义.尽管水稻中卷叶材料比较丰富，但对其遗传和分子生物学研究却比较缺乏.迄今, 在Gramene网站上公布了 6个控制卷叶的隐性基因rl1, rl2, rl3, rl4, rl5和rl6,分别标 定在经典遗传图的第1,4, 12, 1, 3和7染色体上.另外,李仕贵等人7和邵元

4、健等人 8分别在第5染色体的RG13-RG57和RM6954-RM6841区间内定位到一个隐性卷 叶基因(rl7和rl8,顾兴友等人9在日本流岗卷叶粳中发现一个不完全显性方式遗传 的卷叶基因Rl(t.除rl7和rl8外，其余卷叶基因均未在分子图谱上定位.我们利用 60Co- Y射线辐射水稻品种中花11,获得了一个卷叶突变体,其主要特征为叶片高度 卷曲成筒状，结实率低,籽粒小而畸形.对该突变体初步的遗传分析表明，该突变体的 卷叶性状为单个隐性基因控制.根据该突变体的表型特征和基因所在染色体的位置，推断本研究中的卷叶基因是一个新卷叶基因，将其命名为rl9(t.本研究应用已经公布的 SSR(simp

5、le seque nee re-pea标记和根据已经测定的水 稻基因组序列发展STS标记对Rl9(t基因进行精细定位.1材料与方法(i供试材料.本研究以60Co- 丫射线辐照粳稻水稻品种中花11的干种子,在 M2代得到卷叶突变体(rl9(t,经过连续多代自交种植，确认该突变体性状能稳定遗传； 平展叶材料包括野生型品种中花 11(粳稻,籼稻品种Dular和南京11(N11.(ii叶片的细胞结构观察.在57叶龄期分别取rl9(t突变体和正常植株的新鲜 叶片，直接作徒手切片,在Leica DMRXA显微镜下观察拍照.(iii F2遗传群体的构建.2003年夏在扬州大学农学院试验农场以rl9(t突变体

6、为 母本分别与中花11, Dular和N11杂交,同年于海南种植F1,2004夏在扬州种植亲本,F1和F2群体,单本栽插.田间管理同一般大田.2005年春在海南扩大种植F2(rl9(t 突变体/Dular群体.抽穗后对各分离群体中植株叶片和穗部性状进行调查.(iv初步定位 rl9(t突变体与Dular杂交的F2代所得的169株卷叶单株组成定 位群体,分别提取每个单株的基因组 DNA,水稻基因组DNA的提取采取CTAB法 10.以BSA法11建成卷叶池和非卷叶池(各15株DNA等量混合,利用微卫星标记对分离群体的2个亲本进行多态性分析，并进一步利用多态标记分尙I %丄屉第50卷第24期2005年

7、12月论文析两池间的多态性，找出可能与卷叶基因连锁的标记，然后用找出的连锁标记对 F2群体中各卷叶单株进行分析.SSR分析中所用到的引物序列引自http:/ /.引物由上海生工公司合成，25 L返应体系中包括10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.3, 50 mmol/L KCl, 1.5 mmol/L MgCI2, 1 U Taq 酶,4 nmol/L dNTP, 10 pmol/L引物，20 ng模板DNA.在Biometra PCR仪上进行PCR扩增，反应条件为： 94°C 预变性 5 mi n; 94°C , 1 min, 5

8、5°C , 1 min, 72°C, 1.5 min, 33 个循环;72 C 延伸 10 min.反应产物首先在3%琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，并 在BIORAD凝胶成像仪上成像.如果在3%琼脂糖凝胶上电泳没有多态，则在6%垂 直平板聚丙烯酰胺凝胶上电泳，经0.1%硝酸银染色后观测.(v精细定位.根据初步定位的结果和已公布的水稻品种 93-11和日本晴全基因 组序列，利用Primer Premier 5.0软件，在目标基因所在染色体区域的 PAC克隆上设 计STS标记进行精细定位.引物合成，PCR反应和电泳分析条件同上.(vi遗传作图.根据SSR分析

9、的结果，用MAPMAKER3.012软件进行连锁分析 利用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(centiMorgan, cM.2结果与分析2.1卷叶突变体的表型特征正常情况下，rl9(t突变体叶片均沿中脉纵向内卷，外观近似圆筒状，在整个生育 期中，叶片始终表现高度卷曲该突变体的生育期、株高、分蘖力等农艺性状与中花 11没有明显差别，但是穗部性状与中花11明显不同，表现为颖花发育不良、畸形、 结实率降低在以rl9(t突变体配置的分离群体(F2(rl9(t突变体/Dular, F2(rl9(t突变体 /N11和F2(rl9(t突变体冲花11中，分离出的卷叶单株也都同时表现为颖花畸形，没 有出

10、现二者之间的重组，说明该卷叶基因可能同时控制叶片和颖花的正常发育.为从形态上剖析卷叶形成的原因，我们将卷叶株和正常株的叶片进行徒手切片 观察突变体和野生型植株叶片在结构上的差异.因为在水稻叶片中只有叶肉细胞含 有叶绿素，叶绿素在荧光激发下能发出有色光，荧光显微镜下观察发现，卷叶植株的 叶肉细胞在叶片的下表皮分布较多，在小维管束的外侧都有叶肉细胞的分布(图1(a 和(b;而在平展叶中，叶片两侧的叶肉细胞分布比较均匀，在小维管束的夕卜侧没有叶肉细胞的分布(图1(c和(d.进一步对突变体和野生型植株的叶片结构进行环扫和透射电子显微镜观察，未能发现两者之间存在明显的差异.叶肉细胞在叶片两侧分布不均匀可

11、能是叶片卷曲的重要原因.2.3卷叶突变体的遗传分析为了研究该突变体卷叶性状的遗传特性，我们将rl9(t突变体分别与中花11, Dular和N11杂交，自交，得到了 3个F2群体，考 察了 3个群体中植株的叶片性状，结果列于表1.结果表明，3个组合的杂种F1均表现正常，叶片全部平展；在3个F2群体中出现了明显的分离,分别表现双亲性状，且没有中间类型的植株出现.在rl9(t突变体/中花11的F2群体中,平展叶与卷叶植株数之比为212:66,完全符合3:1的理论分离比,表明该卷叶性状由单个隐 性基因控制但是,在卷叶与Dular和N11配置的F2群体中,卷叶植株与正常植株的比例明显偏离了孟德尔的理论分

12、离比例(1:3,卷叶植株的数目明显偏少.但是在这两个群体中没有分离出叶片卷曲程度中等的个体，而且每个卷叶植株的颖花也同时表现为畸形，与卷叶亲本相似在两个群体中卷叶株偏少可能与籼粳交群体本身的性质有关,带有粳型等位基因的配子的部分败育会造成群体的偏分离13.表1 F1及F2卷叶性状的表现F2卷叶与正常叶植株数a组合F1R F刀X 2(1:3卷叶 / 中花 11 F 66 212 278 0.235卷叶 /Dular F 169 1664 1833 243.435*卷叶 /N11 F 125 1045 1170 127.892*a R,卷叶；F,平展叶；刀总数.:显著水平，P < 0.012

13、.4 RI9（t基因的初步定位用F2（rI9（t突变体/Dular群体作为初步定位群体,以BSA法建成卷叶池和平展叶池（各 15株DNA等量混合,利用600个SSR标记对rI9（t突变体和Dular进行多态性分析，其中两亲本多态性的标记有190个,应用这190个标记对两个DNA池进行多态性分析，发现第9染色体上的微卫星标记 RM5777在两池间表现出多态性，初步表明控制卷叶性状的基因存在于第9染色体.进一步利用第9染色体上在两亲本间表现出多态的标记对F2群体的169株卷叶植株进行分析，证实该基因位于第9染色体上.MAPMAKEER3.0 软件论文第50卷第24期2005年12月图1卷叶（a,

14、b和正常叶（c, d叶片的横切面的细胞结构比较（a和（c为白炽光下的叶片横切面；（b和（d为绿色荧光下的叶片横切面亡兀朮金斥记1 10-RM577?7 FT*RMft475箭头示叶片下表皮小维管束位置连锁分析表明RI9(t基因位于RM6475和RM6839之间,与两标记的遗传距离 分别为5.0和6.9 cM(图2.图2 RI9(t在第9染色体上的初步定位2.5 RI9(t基因的精细定位目标基因的精细定位是进行基因图位克隆的关键，与目标基因紧密连锁分子标 记的确定将为构建覆盖该基因的物理图谱奠定基础为了精细定位RI9(t, 一方面继续扩大F2 (rI9(t突变体/Dualr群体,在海南共种植15

15、00株,其中卷叶株为298株,提 取这些植株的DNA用于基因的精细定位.另一方面在目标基因所在的区段发展新 的标记.本研究中，在RM6475和RM6839之间发展了 30个STS标记，将这些标记 对亲本进行多态性分析，共有24个能扩出单条带，其中7个在亲本间表现出多态性 俵2.进一步利用这7个标记对F2(rI9(t突变体/DuIar群体共467株卷叶单株进行了 连锁分析,结果在PAC克隆AP005904上找到了 1个与RI9(t表现共分离的标记c25. 另外,c23, C28和c29分别存在3, 1和2个交换株,与RI9(t分别相距0.3, 0.1和0.2 cM.2.6覆盖RI9(t的物理图谱

16、的构建通过对RI9(t的精细定位,找到了 6个与RI9(t紧密连锁的分子标记.其中a15, a16位于 PAC 克隆 AP005692上,而 c23, c25, c28和 c29 都位于 PAC 克隆 AP005904 上.PAC克隆AP005904全长155 kb,现已全部测序.根据第9染色体的物理图谱可 知，AP005692和AP005904之间还有两个 PAC克隆，分别是AP005861和AP005129. 根据这些结果构建了覆盖 RI9(t基因的物理图谱(图3,由于c23和c28与RI9(t分别 相距仅0.3和0.1 cM,而c25与RI9(t表现共分离，且这3个标记都位于同一个PAC

17、 克隆上，因此根据它们在PAC上的位置，可以推断RI9(t位于AP005904上c23和 c28之间大约42 kb的区段内，这为RI9(t基因的图位克隆奠定了基础.3讨论叶片是水稻最主要的同化器官.叶片的姿态，大小及其光合能力在株型改良及高 产栽培体系中一直第50卷第24期2005年12月论文表2新发展的在两亲本间表现多态的部分 STS标记标记引物序列所在PAC片段大小/bp5-GTTCATGGGTTTGAGGAGTG- 3' a155-GAAGGGTTGATGTCAGAGGG- 3' AP005692 2675 -CGGTCAGTCACTTGAGCCATAC- 3 '

18、 a16-5 'GTCCAAAGGGCAAACGACATAG- 3 ' AP005692 1895 -CAAAAAAAGACAAGCAAGCAC- 3 ' c19 -ATTGGAAATCACTACCGT- 3AP005904 3195 -GTCAAAGTCATCAAACGG- 3 ' c23-TG'GTCAACCCAGCAAAGA- 3'AP005904 2635 -TTGCGTTGTTCACGACTC- 3 ' c25-ATGTGGGCTTTCACTGGC- 3'AP005904 4145 -CATCTCCTCGTCCAGCAT

19、C- 3 'c28 5 -TACTACTTTCCCGTTCCGT- 3 ' AP005904 4255 -ATTCCTCTATGTTTCCTGC- 3 ' c29TTAATCTCATCGTCCCTGG- 3 'AP005904 237彳示记或基因遗巧趾离九何图3 R I 9（t在第9染色体上相应区段的跨叠 PAC克隆群是水稻遗传育种家和栽培学家关注的焦点.袁隆平1提出的水稻超高产株型模式中明确提出了水稻上3张叶片要 长,直,窄，凹,厚”其中叶片的 凹”即指叶片的卷曲，叶片的适度卷曲既可以提高光能利用率2,又可 以改善群体的通风透光条件，提高群体的质量3,4.叶片

20、仅仅由几种不同类型的细胞构成，但其发育却是一个十分复杂的过程 14,15.从叶片形态构造分析，叶片的发育包括叶原基的起始、叶片的近轴/远轴 （adaxial-abaxial发育、近端/远端（proximal-distal发育、叶片侧向发育等.后三者概 括称为叶片的轴性发育，直接影响到叶片的形态.近年来,对植物叶片的发育研究主要依赖于拟南芥和玉米研究中积累的突变体.已有研究表明，叶片的近轴/远轴面的不对称发育与毛状体、光合作用细胞、气孔、海绵组织和栅栏组 织的分布直接相关.第1个有关近轴/远轴面的突变体是在金鱼草（Antirrhinum majus 中发现的低温敏感性突变体（phantastic

21、a , phan . phar突变体叶片近轴面的边缘区域 出现远轴面组织,发育后期叶片呈放射状,变得完全远轴化16. phan基因编码在侧 生组织原基中表达的MYB家族的转录因子,是KNOX基因的负调控因子17,18. 另一个与背腹性发育有关的是 YABB丫基因家族，这些基因是植物特异的，至少包 括6个家族成员，比如拟南芥中的FILAMENTOUS论文第50卷第24期2005年12月FLOWER(FIL, CRABS CLAW(CRC 以及 INNER NO OUTER1922. YABBY基因编码具有一个锌指环和一个螺旋-环-螺旋基序的蛋白，可能是一个转录调控元 件1921. YABBY基因

22、在远轴面表达，该家族基因的突变会导致远轴面模式的丧失. 在拟南芥中显性突变基因 phabulosa (phb-1d以及PINHEAD (PNH和ARGONAUTE(AGO 突变都会破坏叶片的轴性发育2325.在玉米中，Ibl1基因突变, 影响了近轴面细胞的属性，导致叶片叶肉细胞不同程度的丧失26;另一个不完全显 性卷叶突变体Rolled leaf1(Rld1,叶片表现内卷，野生型基因rld1在叶片的近轴面表 达27,28.总体上，叶片背腹性的建立需要 PHAN, LBL, AGO, PNH, PHB等基因或 其调控分生组织的下游靶基因.近年来研究发现，microRNA在叶片的发育中也起十分重要

23、的作用29,30. microRNA调控的基因包括叶片近轴/远轴发育的基因.例如拟南芥中与叶片极性发 育相关的基因PHB, PHV和YABBY等都受到microRNA的调控31,32,玉米中不 完全显性突变体Rld-1的研究发现，突变体叶片的卷曲也受到 microRNA的调控28.Sunkar等人33在水稻中所发现的 35个microRNA中有14个新的microRNA,其中 有1个调节与维管束木质化有关的蛋白.在水稻中，已分离出与拟南芥PNH/ZLL的同源基因OSPNH1,研究发现， OSPNH1与叶片的近轴发育有关，该基因在发育的叶原基，特别在发育的维管束组织, 叶原基的近轴区域的少数几层

24、细胞以及将来发育成叶鞘扩张细胞中强烈表达.将该基因的反乂基因导入水稻后，引起叶片畸形，叶片中的维管束分布以及内部结构都发生了明显的改变，推测该基因不仅能维持顶端分生组织的正常功能，同时与维管束的形成密切相关34.水稻中与维持顶端分生组织功能的 KNOX家族的同源基因已有 许多,包括OSH1, Oskn2, Oskn3, OSH16, OSH15, OSH17等,这些基因的突变会引起 叶鞘向叶片中延伸，叶片的近轴面出现叶舌或叶耳35,36.但在已有的关于水稻叶片 发育的研究中，叶片发育的分子机理仍然不明了 ，特别是对卷叶性状的遗传基础和调 控途径的认识还十分有限.利用水稻存在的大量突变体研究叶片

25、发育的分子机理必 将推动人们对植物叶片发育调控的认识.研究中，植株在叶片结构上与野生型明显不同，在叶片的远轴面上叶肉细胞的分 布明显增多，在维管束的外侧分布有较多的叶肉细胞，而在野生型中小维管束的外侧 没有叶肉细胞的分布，是否是由于水稻中控制叶片近轴/远轴面的基因发生了突变造 成叶肉细胞的分布不均匀，有待进一步研究.另外,卷叶和颖花畸形两个性状始终表 现为紧密连锁，说明RI9(t基因可能影响多个发育途径，这一现象在植物中较为普遍 比如矮秆基因d1同时影响了株高和粒形等性状37.因此对该卷叶突变体进行基因 克隆和功能分析不仅对水稻株型的改良具有重要的实践意义 ，而且对水稻叶片和粒 形发育的分子机

26、理研究也具有重要的理论价值.图位克隆是基于遗传图谱和物理图谱分离基因的一种重要方法.通过图位克隆方法获得基因的关键在于构建精细的遗传图谱，通过精细定位尽可能将目的基因限 定在一个相对较小的区域内，然后构建覆盖目的基因的物理图谱，筛选和鉴定候选基 因.在本研究中,Rl9(t基因定位于第9染色体的STS标记c23和c28之间,与c23相 距0.3 cM,与c28相距0.1 cM,与c25表现共分离.据此，构建了覆盖Rl9(t基因区域 的PAC重叠群,将Rl9(t基因限定在 AP005904上约42 kb的区段内.根据TIGR网 站上提供的基因注释信息，在定位的42 kb区域内共预测到3个可能的基因

27、：第一个 是假定蛋白基因；第二个是属于En/Spm亚族的转座子；第三个是含有类似MYB- DNA结合域的转录因子基因.该预测为进一步进行基因的精细定位和候选基因的确 定提供了依据.尽管本研究中用于基因精细定位的群体只有467株,却将目标基因锚定在一个42 kb的区段上,每一遗传单位(1 cM相当于物理距离100 kb,远远低于平均值200 kb,推测该区段是一个交换热点，这为进一步精细定位和克隆该基因奠定了 基础.致谢本研究为国家自然科学基金(批准号：30270809, 30300220和国家重点基础 研究发展规划(批准号：2005CB120804资助项目.参考文献1袁隆平杂交水稻超高产育种杂

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