蛋白免疫印迹法Western blot 原理及步骤

1、蛋白免疫印迹法Western blotWestern Blot的原理首先利用首先利用SDS-PAGESDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如固相载体（例如NCNC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NCNC膜就称为一个印迹膜就称为一个印迹（blotblot）, ,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%5%的的BSABSA或脱或

2、脱脂奶粉溶液）处理以封闭脂奶粉溶液）处理以封闭NCNC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体。处理后，带

3、有标记的二抗与一抗结合标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。印迹用酶形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术主要应用于检测蛋就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术主要应用于检测蛋白水平的表达。白水平的表达。SDS-PAGE原理 SDS-PAGE SDS-PAGE ：是在蛋白质

4、样品中加入：是在蛋白质样品中加入SDSSDS和含有巯基乙醇的样品处理液，和含有巯基乙醇的样品处理液，是一种很强的是一种很强的，它可以，它可以，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇等可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质强还原剂巯基乙醇等可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDSSDS充分结合形成带充分结合形成带负电荷的蛋白质负电荷的蛋白质-SDS-SDS复合物复合物 蛋白质分子结合蛋白质分子结合SDSSDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有

5、的净阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。Western blot 内容v蛋白样品的制备vSDS-PAGEv转膜v封闭v一抗杂交v二抗杂交v底物显色步骤v蛋白样品的制备v1，在冰上收细胞，用PBS清洗两次，洗去培养基。1500r,5min离心，弃去上清液。v2，裂解细胞（裂解液:PI:PMSF=100:1:1）,根据所需蛋白浓度加细胞裂解液。混

6、匀。于冰上裂解20min。v3，14000r,10min离心。上清液即为所需蛋白样品液。v4，用Bradford蛋白分析法测蛋白浓度。v5，按100ul裂解液加30ul的6X的loading buffer 的比例，向蛋白样品液中添加loading buffer 。v6，于95 ，5min条件下对蛋白样品进行高温变性。vSDS-PAGE:v1，灌胶：v （1）保证玻璃板干燥洁净，玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶。v （2）配好分离胶，加入TEMED，混匀后即可灌胶。灌胶过程中胶要沿着玻璃板流下，防止有气泡产生。将胶灌至接近绿带中线即可。v （3）用去离子水进行液封，胶凝速度会更快

7、（加水时速度要慢，防止胶被冲变形）v （4）待水与胶之间有一条折射线的时，说明胶已经凝固。此时，可完全除去胶上层的水。v （5）配制浓缩胶，加入TEMED,混匀后将剩余空间灌满浓缩胶。然后插入梳子。待浓缩胶凝固后小心拔出梳子。v （6）用水冲洗一下胶板，装入电泳槽中（小玻板面向内，大玻板向外；若只跑一块板，槽的另一边要放一块塑料板，有字的一面向外）v2，电泳 向电解槽中加入适量的Running Buffer,将蛋白样品以50ug的标准换算出的体积进行上样。以电压120V或160V进行电泳，电泳至前沿跑至最底端即可进行转膜。 转膜 用硝酸纤维素膜（NC膜），进行转膜。组装转膜“三明治”的过程在T

8、ransfer buffer中进行：黑的一面在下，依次放上滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，然后合上三明治。整个过程必须保证无气泡。接着把转膜“三明治”放入转膜槽中，注意正负极放置正确。倒入适量的Transfer buffer。在冰浴中进行转膜。转膜条件：120V,1.5h或者150V，1h 封闭 转膜结束后，取出NC膜，按照所需蛋白的位置，裁剪NC膜。使其浸润于封闭液中，缓慢摇荡1hv一抗杂交v 封闭过后，把NC膜放入塑料袋中，按膜的大小加入适量的一抗溶液（一抗：封闭液=1:1000），密封，在摇床上缓慢摇荡孵育4h。v二抗杂交v 一抗孵育完成后，取出NC膜，交替加入TBST和TBS进行洗膜，一共洗三次，每次710min。然后，再将NC膜放入塑料袋中，加入酶标二抗（一抗的抗体，含辣根过氧化物酶HRP）（二抗：封闭液=1:1000），密封，在摇床上缓慢摇荡孵育45min1h。最后再次洗膜（同上）v底物显色v取上述处理过的NC膜