高效液相色谱法检测六种氟喹诺酮类兽药残留前处理的优化

1、收稿日期:2010-07-01;修订日期:2010-09-10作者简介:潘 媛(1982-,女,工程师;E -m ai:l me i m e-i 82909163.co m高效液相色谱法检测六种氟喹诺酮类兽药残留前处理的优化潘 媛*,牛 华,程晓云,祝红昆,申南玉,李 波,冯 雷,珠 娜,牛之瑞(云南省产品质量监督检验研究院;昆明650223摘 要:建立了一个检测动物源性食品中6种氟喹诺酮类药物残留的高效液相色谱方法。不同基质的样品前处理对检测影响较大:鱼、肉及肝脏等样品需经过乙腈-011m o l/L KH 2PO 4缓冲液提取,乙腈饱和的正己烷洗涤去除油脂;蛋及乳制品样品用正己烷饱和的乙腈

2、提取,乙腈饱和的正己烷去脂。目标化合物采用高效液相色谱-荧光检测器检测,外标法定量。对市售鸡肉、猪肉、鸡蛋进行检测,添加10、20、50、100L g /kg 浓度水平时,回收率在82%105%之间,相对标准偏差在4%12%之间,方法的检出限诺氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星及单诺沙星为510L g /Kg ,恩诺沙星、达氟沙星为310L g /Kg 。关键词:氟喹诺酮;高效液相色谱法;荧光检测器;动源性食品中图分类号:O65717 文献标识码:A 文章编号:1000-0720(201105-069-04氟喹诺酮类(Fluoroqu i n o l o nes抗生素进入我国仅仅20多年,耐药率已经达

3、60%70%。目前,有近10种氟喹诺酮类药物应用于畜、禽、水产养殖业,而FQs 残留的检测方法未有食品检测国家标准,且仅有农业部无公害类产品对环丙沙星(C I P 011m g /Kg和恩诺沙星(ENR 011mg /Kg有限量要求。所采用的检测方法一般有高效液相色谱-紫外检测法1、高效液相色谱-荧光检测法2、液相色谱-串联质谱法、气相色谱-质谱法、微生物法3等。利用高效液相色谱荧光检测器对动物源食品中FQs 药物残留进行检测,不仅成本较低,经改进,前处理简单易行,可满足我国现行兽药残留检测分析的要求。1 材料与方法111 仪器与试剂HPLC -20A 高效液相色谱仪,配10AXL 荧光检测器

4、及Analysis 数据处理系统(日本岛津公司;超声波仪;乙腈、正己烷(色谱纯;KH 2PO 4、H 3PO 4(分析纯;固相萃取装置;三乙胺(分析纯;四丁基溴化铵(分析纯;P H S -2型精密酸度计。色谱柱:G rance A llti m a C 18柱(416mm 150mm 色谱柱,SPE -C 18小柱(6m g ,3cc。诺氟沙星(NOR 、环丙沙星(C IP、恩诺沙星(ENR、沙拉沙星(SAR 、单诺沙星(DAN 、双氟沙星(D I F,纯度>99%,配制浓度为1m g /m L 的标准储备液,乙腈定容,避光4e 保存3个月,使用液逐级稀释,现用现配。112 色谱条件流动

5、相(A 为乙腈,(B 为0105m o l/L H 3PO 4含014%三乙胺(V /V ,使用前过滤脱气,流速1mL /m i n ,柱温:35e ,进样量:10L L ;荧光检测器激发波长(K ex 248nm,发射波长(K e m :445nm 。考虑到被测物质的复杂性,使用梯度洗脱程序(见表1,分析结束后将乙腈提至90%,冲出样品中的表1 梯度洗脱程序Tab .1 G rad i en t e l u ti on progra m分析时间t /m i n 流动相A /%(CH 3CN 流动相B /%01684151684209010259010251684301684荧光物质,保证连续

6、进样时数据的准确性,并起到保护柱子的作用。113样品的前处理鱼、肌肉类及肝脏类:样品(鱼去鳞去皮均质后准确称取均匀样品510g(精确至0101g于50mL聚丙烯离心管中,加入15mL经N a OH调节p H至714的011m o l/L KH2PO4-乙腈缓冲液(1B3, V/V,充分提取两次,移取上清液至50mL比色管中,分次加入乙腈饱和的正己烷洗涤至澄清,留取下层澄清液体,50e氮吹至干,用2mL乙腈溶解残渣,经0122L m滤膜过滤后进行分析。蛋及奶制品:准确称取均匀样品210g(精确至0101g,加经正己烷饱和的乙腈10mL涡旋振荡均匀,过滤并洗涤,合并于25mL比色管中,加入10mL

7、乙腈饱和的正己烷溶液涡旋振荡洗涤至澄清,弃去上层液体,下层液体氮吹至干,加2mL乙腈溶解残渣,过0122L m滤膜后进行分析。2结果与分析211流动相的选择参照农业部方法对FQs类物质进行分离4,在流动相的选择上多采用磷酸盐缓冲溶液或经调pH值的酸性水溶液5,然而C18柱上却不能得到良好分离,普遍存在出峰过早、标准品之间分离不完全、峰拖尾等情况。氟喹诺酮类药物在酸性水溶液中通常以离子形式存在6,文献报道多采用磷酸/三乙胺7、磷酸盐/四丁基溴化铵及磷酸/庚烷磺酸钠体系8。本试验对比了四丁基溴化铵和三乙胺两种离子对试剂,选用0105m ol/L KH2PO4-01015m o l/L四丁基溴化铵缓

8、冲盐B乙腈=90%B10%,满足分离要求,但存在平衡时间长,流动相需调节pH等步骤;若选用0105m o l/L H3PO4含014%三乙胺(V/V:乙腈=84%B16%作为流动相,六种FQ s在15m i n内均能达到基线有效分离,此时流动相p H在4左右1,有效避免了杂峰的干扰。212方法的检出限及标准曲线对浓度不同的混合标准使用液进行色谱分析,工作曲线的线性范围、回归方程、相关系数见表2。可见,本方法灵敏度高、线性范围较宽,有一定的实用价值。表2方法的线性范围、回归方程与相关系数Tab.2Th e li near ran ges,regression equations and corr

9、elation coefficien ts氟喹诺酮线性范围w/(L g/K g回归方程检出限w/(L g/kgr诺氟沙星(NOR5200Y=4114107x+345159895019972环丙沙星(CIP5200Y=4154107x+212119025019999单诺沙星(DAN3200Y=4197107x+162111713019998恩诺沙星(E HR3200Y=4101107x+398102053019999沙拉沙星(SAR5200Y=3196107x+617191475019964双氟沙星(D I F5200Y=4160107x+177106825019957 Y:峰面积,x:被则物含

10、量213样品前处理方法的优化动物源食品中基质干扰复杂,富含大量脂肪和蛋白质,选择并优化样品前处理方法对结果的准确性尤为重要。实验对肌肉类、肝脏类及鱼虾、蛋、乳制品类的前处理进行了优化比较。按照农业部方法4,鱼、蛋及乳制品中含有大量脂肪、蛋白质、氨基酸等干扰物质,样品组织提取液一般呈浑浊状态,直接进入固相萃取柱,净化效果并不理想,而且会造成小柱的堵塞,且目标物在前处理过程中回收率低、不稳定,增大了残留检测的难度。采用上述实验方法进行液-液萃取,用异丙醇溶解氮吹干后的残渣,发现虽然残渣溶解比较充分,但杂峰干扰太多,低浓度时基本无法定量,对回收率的贡献也并不明显;实验发现对鱼肉中FQ s药物残留检测

11、影响较大的是提取液磷酸盐缓冲液的pH值,未经p H调节时,鱼肉中残留检测回收率极不稳定,基线抖动剧烈,后经Na OH调节p H值到714时,情况大有改善(见图1;对于蛋及乳制品,特别在残留分图1鱼肉组织色谱图Fig11Chro m atogra m s of fish sa mp lesA-空白加标;B-空白样品1-诺氟沙星810;2-环丙沙星810;3-单诺沙星810;4-恩诺沙星610;5-沙拉沙星810;6-双氟沙星810(10-6%析测定时直接浓缩进样易产生杂质干扰,若采用乙腈饱和的正己烷则可将脂溶性杂质进一步净化。实验比较了用丙酮、甲醇、乙腈、乙酸乙酯的提取效果,综合考虑对残留目标化

12、合物的提取率;易产生高度混浊滤液的样品中杂质的影响程度;浓缩富集的便利程度等几个因素,结果是以正己烷饱和的乙腈为优。分别试验了采用混合溶剂提取的效果,乙腈-丙酮,乙酸乙酯-甲醇,实验发现溶剂比例对目标化合物的影响较大,并且对某些基质样品提取的杂质较多,最终确定蛋及乳制品选择直接加入正己烷饱和的乙腈溶液沉淀蛋白,用乙腈饱和的正己烷溶液去除脂肪等干扰物质,效果较好。3结论将新鲜配制的混合标准使用液30L g/Kg (30ppb4e冰箱避光保存1、3、5、7d后上机检测,被测物质保留时间基本不变,但浓度降低明显,多有杂质峰出现。因此在检测过程中应做到现做现配,样品处理也需及时上机,方能保证数据的可靠

13、性。在样品添加各个标准品至最小量确定本实验的检出限,仪器的检出限可达015L g/K g,但在实际残留量测定过程中,回收率不可得,变异系数较大。考虑到样品复杂的基体干扰,方法检出限为诺氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星及单诺沙星为5L g/Kg、,恩诺沙星、达氟沙星为3L g/K g9。FQ s类药物残留的检测根据上述方法,经过市场采集,检测市售30个猪肉样品、30个鱼类样品、30个鸡肉样品和30个鸡蛋样品,发现一例猪肉诺氟沙星阳性,结果为3217L g/K g。添加10、20、50、100L g/Kg浓度水平,该方法回收率稳定(见表3,数据准确可靠,对于大规模的检测筛查,是较为理想的检测方法。表3六

14、种喹诺酮类药物残留的加标回收率(n=3 Tab.3Th e recoveries of three qu i n ol one an ti m icrob i a ls(n=3加入量w/(L g/kg化合物平均回收率/%猪肉鱼类鸡蛋鸡肉R SD/%猪肉鱼类鸡蛋鸡肉10NORCIPDANE NRS ARD I F901682119210861283118214821082118316841584128310861194148615951589168411831983169112851384189019119128199101071212121091410816619415619513710617

15、816101261241491320NORCIPDANE NRS ARD I F86138619961999139215911585169013941387148311861688199512871889109011871291179012881894148619941910121091711917121291911713712119167179178196171191111109151050NORCIPDANE NRS ARD I F90131021892169218901794159011951696149117851485158712101149719102129813103169713

16、901191161011487119211614616716109157137147159138144118198138171271510119118131181871912 续表3(Con ti nued T ab.3加入量w/(L g/kg化合物平均回收率/%猪肉鱼类鸡蛋鸡肉R SD/%猪肉鱼类鸡蛋鸡肉100NORCIPDANE NRS ARD I F9418931210417101151001010210101149614971097168914901895121011499111041597149916931810318105109911961710110513712410819718

17、9196185129126141211811812818714819116117131241011916参考文献1G igososP G,R evesado P R,CadahiaO.J Chrom atogrA,2000,871:312刘媛,谢孟峡,丁岚,等.分析化学,2004,32(3:3523L isianeS E,E lfr i des E S S.J Phar m B i om ed A na,l2002:914杨先乐,胡鲲,杨勇,等.农业部第783号公告-2-20065Zhenli ng Z,A i guo D,G ui x i ang Y.J Chro m a t og r B,

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19、iao-yun,Z H U H ong-kun,SHE N N an-yu,LI Bo,FENG L ei,Z H U N a and N IU Zhi-rui(Yunnan Prov i n c i a l Institute of Product Quality Superv isi o n and I nspecti o n,Kunm i n g650223, Fenx i Sh i y ansh,i2011,30(5:6972Abst ract:A m othod for analyzing6fl u oroqu i n o lones(FQSresi d ues i n ani m al deri v ed foods by h i g h perfor m ance liquid chro m atog raphy w as proposed.The sa m p le pretreat m ent of different substrates w ere opti m ized,fish,m eat and liver sa m ples w ere ex tracted by C H3CN-011m ol/L KH2PO4buffer so l u ti o n,egg s and dairy pr