疫苗生物技术

1、疫苗生物技术疫苗生物技术英国医生爱德华英国医生爱德华. .詹纳（詹纳（1749-18231749-1823）研究天花疫苗研究天花疫苗（牛痘）的过程（牛痘）的过程1.1.天花是一种死亡率很高的传染病。天花是一种死亡率很高的传染病。1818世纪前还没有世纪前还没有预防天花的有效方法，每当天花流行，就有大量患者预防天花的有效方法，每当天花流行，就有大量患者死亡，存活下来的人的脸上也会留下疤痕。死亡，存活下来的人的脸上也会留下疤痕。詹纳还知詹纳还知道，中国人在宋朝的时候已经发明了往健康人的鼻孔道，中国人在宋朝的时候已经发明了往健康人的鼻孔里吹痘痂粉的方法预防天花。里吹痘痂粉的方法预防天花。但这种方法并

2、不安全，但这种方法并不安全，有时会导致人的死亡。有时会导致人的死亡。天花病人局部痂皮天花病人局部痂皮鼻鼻儿儿 童童中国古代中国古代“种人痘种人痘”2.2.为了根绝可怕的天花，詹纳决心寻找更有为了根绝可怕的天花，詹纳决心寻找更有效的办法。通过广泛的调查，发现两种人不效的办法。通过广泛的调查，发现两种人不会得天花：会得天花：一种是患过天花的人；另一种是一种是患过天花的人；另一种是养牛场的挤牛奶女工养牛场的挤牛奶女工. .英国医生爱德华英国医生爱德华. .詹纳詹纳（1749-18231749-1823）研究）研究天花疫苗（牛痘）的天花疫苗（牛痘）的过程过程3.3.这时，詹纳这时，詹纳的调查重点放的调

3、查重点放在在挤奶女工的身上挤奶女工的身上 挤奶女工告诉他挤奶女工告诉他: :牛也会患天花牛也会患天花, ,患病时在牛患病时在牛的皮肤上出现一些小脓包的皮肤上出现一些小脓包, ,叫牛痘。女工们在叫牛痘。女工们在给患病的牛挤奶时，给患病的牛挤奶时，也会被感染牛痘而引起小也会被感染牛痘而引起小脓包，但很快就痊愈脓包，但很快就痊愈，以后她们就不会再得天，以后她们就不会再得天花，于是詹纳猜想其中必有奥妙。花，于是詹纳猜想其中必有奥妙。、患过牛痘的人、患过牛痘的人能产生对天花的能产生对天花的抵抗能力抵抗能力5.5.为了检验猜想为了检验猜想, ,他用实验来证实他用实验来证实从患过牛痘的挤奶从患过牛痘的挤奶女

4、工手上取出微量女工手上取出微量的牛痘脓浆的牛痘脓浆, ,接种接种到一个八岁男孩的到一个八岁男孩的胳臂上胳臂上, ,使他染上使他染上牛痘。但几天后小牛痘。但几天后小男孩的牛痘很快就男孩的牛痘很快就好了。好了。一个多月后，詹纳在小男孩的胳臂上再接种人一个多月后，詹纳在小男孩的胳臂上再接种人类的天花脓浆，小男孩竟没有患上天花。类的天花脓浆，小男孩竟没有患上天花。实验证实了他的实验证实了他的假设是正确的，假设是正确的，同时表明，患过同时表明，患过牛痘的人体内产牛痘的人体内产生了能抵抗天花生了能抵抗天花病毒的病毒的抗体抗体疫苗发展的三个时期疫苗发展的三个时期第二次疫苗革命第二次疫苗革命第三次疫苗革命第三

5、次疫苗革命第一次疫苗革命第一次疫苗革命在在Pasteur减毒培减毒培养制备疫苗方法的养制备疫苗方法的指导下，指导下，19世纪末世纪末至至20世纪初在世界世纪初在世界上掀起了以细菌减上掀起了以细菌减毒活疫苗毒活疫苗卡介苗卡介苗为代表的第一次疫为代表的第一次疫苗革命。苗革命。 在分子水平上进行在分子水平上进行重组疫苗的研究和重组疫苗的研究和制备。采用重组制备。采用重组DNA技术制备的乙技术制备的乙型肝炎表面抗原疫型肝炎表面抗原疫苗是第二次疫苗革苗是第二次疫苗革命的代表。命的代表。 DNA疫苗开发为免疫疫苗开发为免疫学研究开辟了一个全学研究开辟了一个全新的天地。新的天地。DNA疫苗疫苗能在真核细胞中

6、表达能在真核细胞中表达抗原，刺激机体产生抗原，刺激机体产生特异性免疫反应，可特异性免疫反应，可有效地预防病毒、细有效地预防病毒、细胞内寄生的细菌和寄胞内寄生的细菌和寄生虫所引起的传染病生虫所引起的传染病。 *减毒疫苗的发明减毒疫苗的发明19 19 世纪末，随着微生物学的世纪末，随着微生物学的发展，法国免疫学家巴斯德发展，法国免疫学家巴斯德（PasteurPasteur）和德国细菌学家）和德国细菌学家郭霍（郭霍（KochKoch）在创立了细菌）在创立了细菌分离培养技术的基础上，通分离培养技术的基础上，通过系统地科学研究，利用物过系统地科学研究，利用物理、化学，以及生物学方法理、化学，以及生物学方

7、法获得了减毒菌苗，并用于疾获得了减毒菌苗，并用于疾病的预防和治疗。病的预防和治疗。 Pasteur Pasteur 以高温培养法制备了炭疽疫以高温培养法制备了炭疽疫苗，用狂犬病毒在兔体内经苗，用狂犬病毒在兔体内经连续传代制备了狂犬病疫苗。连续传代制备了狂犬病疫苗。这些减毒疫苗的发明不但为这些减毒疫苗的发明不但为实验免疫学打下了基础，也实验免疫学打下了基础，也为疫苗的发展开辟了新局面。为疫苗的发展开辟了新局面。 1879 Robert Koch (1843-1910)发现结核杆发现结核杆菌；提出病菌；提出病原菌致病的原菌致病的概念概念狂犬病疫苗狂犬病疫苗炭疽病疫苗炭疽病疫苗牛分支杆菌牛分支杆菌F

8、 F Mycobacterium bovis 置于含胆汁置于含胆汁的培养基，的培养基，逐渐增加胆逐渐增加胆汁的浓度汁的浓度卡介苗卡介苗 Bacillus Calmette-Guerin （BCG）在胆汁中适应性在胆汁中适应性生长，充分减毒生长，充分减毒成为预防肺结核成为预防肺结核的疫苗。的疫苗。一、疫苗的基本成分、生理作用基础和特征一、疫苗的基本成分、生理作用基础和特征 与普通的化学药物不同，疫苗是由不同性质和作用的物质共同组成的复合物，其基本成分包括抗原、佐剂、防腐剂、稳定剂、灭活剂及其他相关成分。这些基本要素从不同角度确保了疫苗能够有效刺激机体，产生针对病原微生物的特异性免疫反应，同时确保

9、疫苗在制备和保存过程的稳定性。1.1.抗原抗原(antigen) 抗原抗原：在机体内能刺激免疫系统发生应答，并能诱导机体产生可与其起特异性反应的抗体或效应细胞的物质。 抗原的两个基本特性两个基本特性：免疫原性免疫原性和反应原反应原性性。免疫原性（immunogenicity）是指抗原进入机体后引起的免疫细胞间一系列免疫反应，包括抗原加工、处理、呈递以及被T和B细胞的抗原或受体识别等；抗原的反应原性（reactivity）是指抗原与抗体或效应T细胞发生特异反应的特性。 抗原引起的体液免疫抗原引起的体液免疫 根据激活B淋巴细胞的方式不同，抗原可分为两种：蛋白类抗原和多糖、脂类等抗原。 根据对T细胞

10、的依赖性分为：T T细胞依赖性细胞依赖性(TD)抗原和T T细胞非依赖性细胞非依赖性(TI)抗原。蛋白质组成的抗原在T辅助细胞的辅助下，可刺激抗体类型的转化和产生高亲和力的抗体，诱导B淋巴细胞产生以IgG抗体为主的体液免体液免疫反应疫反应及记忆型记忆型B B淋巴细胞淋巴细胞的产生，此类抗原也称胸腺依赖型抗原。 多糖、脂类和核酸等抗原可直接诱导B淋巴细胞产生IgMIgM抗体，但无法诱导T淋巴细胞辅助，因此无法产生亲和突变的抗体反应和记忆型B淋巴细胞。 这类抗原的主要特点是具有由相同的单体聚合形成的多聚性抗原多聚性抗原，它们能同时与B细胞表面多个抗原受体交连，因此能在没有T细胞辅助下直接激活B淋巴

11、细胞，但至今还不清楚B淋巴细胞对这类抗原的反应是否还需要其他信号。此类抗原也称胸胸腺非依赖型抗原腺非依赖型抗原。与蛋白抗原相比，此类抗原引起的免疫反应较弱，记忆期也相对较短免疫反应较弱，记忆期也相对较短。 影响抗原免疫原性因素影响抗原免疫原性因素1 1、抗原的理化性质、抗原的理化性质（一）抗原的种类：多数蛋白质为良好的抗原，多糖及多肽也具一定的免疫原性（二） 分子大小：抗原的分子量一般10kD，且分子量越大，免疫原性越强（三）化学组成：免疫原性物质还须具备复杂的化学组成与特殊的化学基团。（四）抗原决定基的易接近性(accessibility)：易近性乃指抗原决定基是否易被淋巴细胞的抗原受体所接

12、近。（五）物理性状：化学性质相同的抗原物质可因其物理性状不同而影响免疫原性 2、抗原与机体的相互作用 （一） 异物性： “异物”的概念定义为“在胚胎期未与淋巴细胞充分接触过的物质” （二） 进入机体的途径：皮内、皮下、肌肉、腹腔(仅限于动物)、静脉 (三）机体遗传因素：个体对抗原刺激产生应答的能力受遗传因素控制 抗原引起的细胞免疫反应抗原引起的细胞免疫反应 引起细胞免疫反应的抗原主要是一些细胞内生存的活体抗原活体抗原，如艾滋病病毒、结核杆菌、白色念珠菌等。 T细胞介导的细胞免疫反应主要包括：抗细抗细胞内病毒感染胞内病毒感染，如艾滋病病毒、脑炎病毒和仙台病毒等；抗细胞内细菌感染抗细胞内细菌感染，

13、如结核杆菌、麻风杆菌和沙门氏菌等；抗真菌感染，如白色念珠菌等。 2 2、佐剂、佐剂 佐剂是疫苗的关键性成分，可以增强抗原的特异性免疫应答效果。这种加强可表现为增强抗体的体液免疫反应，或表现为增强抗体的细胞免疫反应，或二者兼有。 疫苗佐剂发展至今，以氢氧化铝和磷酸铝为代表的铝佐剂至今仍然是唯一被批准使用的人用疫苗佐剂。 （二）佐剂的作用机制：改变抗原的物理性状，延缓抗原降解和排除，从而更有效地刺激免疫系统；刺激单核/巨噬细胞系统，增强其处理和递呈抗原的能力；刺激淋巴细胞增殖与分化。 （三）佐剂的应用：增强特异性免疫应答，用于预防接种及制备动物抗血清；作为非特异性免疫增强剂，用于抗肿瘤与抗感染的辅

14、助治疗。佐剂佐剂植物来源佐剂植物来源佐剂 1细菌来源佐剂细菌来源佐剂2细胞因子细胞因子3人工合成佐剂人工合成佐剂4植物来源佐剂植物来源佐剂 根据分子量大小可分为低分子提取物和高分子提取物两大类，有活性的小分子包括烷基胺、酚类成分（奎宁、皂角素和倍半萜烯等；具有免疫刺激作用的大分子有蛋白质、多肽、多糖、糖脂和植物凝集素等。 皂角素皂角素是从南美种的皂角树皮提取出的具有免疫刺激活性的一类物质。其中Quil A是皂角素中初步纯化的产品，有促进Thl和Th2 T辅助细胞功能和增强体液免疫的作用。 细菌来源佐剂细菌来源佐剂 细菌毒素细菌毒素：在细菌毒素中，霍乱毒素、大肠杆菌不耐热毒素、百日咳毒素等是一类

15、强粘膜免疫佐剂。 卡介苗佐剂卡介苗佐剂：卡介苗是减毒的牛型分枝杆菌，是预防结核病十分有效的减毒活疫苗。 CpGCpG佐剂佐剂：脱氧寡核苷酸中心区的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）的DNA片段具有活化B细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞的功能。根据此结构在体外合成的CpG基序具有同样的免疫调节效应，CpGCpG寡核寡核苷酸佐剂具有增强细胞免疫和体液免疫的双重效苷酸佐剂具有增强细胞免疫和体液免疫的双重效果果。细胞因子细胞因子 作为第一个被发现具有免疫调控作用的细胞因子白白介素介素1 1（interleukin 1，IL-1），对T细胞依赖和非T细胞依赖性免疫反应均有较好的免疫佐剂作用，目前源于IL-1的多

16、肽已成功用作乙型肝炎表面抗原疫苗的佐剂。 IL-2IL-2作为狂犬病、疱疹以及嗜血流感杆菌疫苗的佐剂，动物试验表明，IL-2可有效增强疫苗的免疫反应，促进抗体的产生。细胞因子不仅可以作为免疫佐剂与抗原结合使用，还可以通过基因重组的方式与其他抗原组成结合疫苗发挥佐剂效应。 人工合成佐剂人工合成佐剂 铝佐剂：铝佐剂只能增强体液免疫增强体液免疫效应，对细胞免疫的增强效果不明显。 脂质体脂质体：脂质体作为疫苗载体时，对多种抗原（蛋白质、多糖或细胞）都具有较好的佐剂效应。脂质体可能通过提高抗原在体内存在时间、加强对免疫系统的刺激，保持和增强免疫反应。实验表明经过脂质体包埋的抗原被吞噬后，抗原在吞噬细胞和

17、抗原呈递细胞中存在的周期大大延长。防腐剂防腐剂 在提高疫苗的保质期方面，防腐剂起到重要的保障作用。常用的防腐剂有甲醛、苯酚、叠氮钠、氯仿、硫柳汞、2苯氧乙等。 稳定剂、灭活剂及其他相关成分 在制备疫苗中常加入适宜的稳定剂或保护剂，如冻干疫苗中常用的乳糖、明胶、山梨醇等，以保证疫苗再加工和存储过程中的稳定性。 在疫苗生产制备中常采用化学试剂灭活，常用的化学灭活有丙酮、苯酚、甲醛、去氧胆酸钠表面活性剂等，在后序的制备程序中应从疫苗中除去，以保证疫苗的安全性。二、疫苗设计的技术基础二、疫苗设计的技术基础 疫苗设计的生物学基础疫苗设计的生物学基础 疫苗设计的安全要求疫苗设计的安全要求 体液免疫或细胞免

18、疫的设计考虑体液免疫或细胞免疫的设计考虑 疫苗设计中疫苗设计中B B细胞、细胞、T T细胞表位选择细胞表位选择 疫苗配方设计疫苗配方设计- -输送系统和佐剂设计输送系统和佐剂设计 疫苗控释技术疫苗控释技术1 1、疫苗设计的生物学基础、疫苗设计的生物学基础 免疫记忆性免疫记忆性是机体对外界致病源最有效的抵抗机制，可保证机体再次遇到同一致病原时迅速启动免疫防御机制，消灭病原体，是疫苗作用的物质基础，免疫记忆系统由体液免疫记忆体液免疫记忆和细胞免疫记忆细胞免疫记忆两部分构成 。 B细胞表面的CD40CD40分子与T淋巴细胞和树突状细胞表面的CD40LCD40L分子的相互作用是B细胞激活和分化所必须的

19、条件。 活B淋巴细胞至少需要两个信号两个信号：第一个信号是B淋巴细胞表面抗原受体的交连，第二个信号则是B淋巴细胞表面所表达的CD40分子和CD4T辅助细胞表面CD40L分子的相互作用。 T辅助细胞所分泌的细胞因子，如白介素2、白介素4、白介素5、干扰素和肿瘤坏死因子等对B淋巴细胞的激活也有重要作用。 记忆型B淋巴细胞是在淋巴组织的生发中心形成的。在记忆型B淋巴细胞的形成过程中，B淋巴细胞膜上的CD40CD40分子起着关键的作用。 幼稚T细胞受到抗原递呈细胞（APC）的激活后，迅速增殖，分化出大量特异性效应细胞效应细胞，实现免疫反应。反应结束后，大部分效应细胞程序性死亡，部分细胞转化为记忆性记忆

20、性T T细胞细胞长期存在。 记忆性细胞在体内高质量存在，必须有一动态的自我平衡过程自我平衡过程。在不同的信号刺激下，自我更新，才能保证记忆细胞长期存活。 抗原存在的持续过程抗原存在的持续过程可能是记忆细胞产生的一个重要因素，那些在反应终结注定要被清除的细胞可能就是那些执行了持续反应反应的后代，它们以较高强度接触抗原的过程即是启动了死亡旁路启动了死亡旁路的过程的过程。相反，在接近反应后期的那些细胞，短暂的接触抗原可能已可以使这些细胞增殖并分化成为效应细胞，但都不足以启动各种死亡旁路。因些，它们不象其他效应细胞那样在感染终结后被清除，而是作为记忆细胞记忆细胞长期存活下去。 记忆的基本过程对疫苗设计

21、提出了较有意义的技术挑战，在设计一种疫苗时，能够在免疫应答的后期免疫应答的后期，以相应的技术减少效应细胞的死亡，就有可能增加记忆细胞的增加记忆细胞的数量数量，而以后的二次免疫应答，就可能因为较多的产生记忆细胞存在而得以更好地发挥作用。2 2、疫苗设计的安全要求、疫苗设计的安全要求 疫苗反应可被划分为“常见”和“罕见”。绝大多数疫苗反应系为“常见”，轻微、不需治疗、并不造成长期结果。 常见、轻度疫苗反应及发生率常见、轻度疫苗反应及发生率：疫苗的目的是通过调动疫苗接受者的免疫系统对这种疫苗的特异性反应而产生免疫效力，机体由此产生的局部反应、发烧和全身性症状可作为部分正常免疫反应，最常见的为接种部位

22、疼痛、肿胀或发红等局部反应。 罕见、较严重的反应发生率罕见、较严重的反应发生率：多数罕见的疫苗反应表现为癫痫发作、血小板减少、低渗低反应症状、持续的极度沮丧的尖叫等，严重的可能具有生命危险。但这些反应具有明显的自限性，治疗后不会产生长期问题和影响。 规划失误规划失误：这种失误通常由人为因素造成，而不是疫苗或其它技术的问题。 避免规划失误的基本原则包括： 每次注射都使用无菌针头和注射器，建议使用一次性灭菌器具。 只使用疫苗提供的稀释液进行还原。 在6小时之后必须废弃已还原的疫苗（麻疹、黄热病和卡介苗），绝不能用隔夜的还原疫苗。 遵循世界卫生组织关于多份瓶装疫苗重新使用的原则（EPI 199）。

23、不能将药品和其它物质与疫苗装入同一冰箱。 对工作人员进行恰当的培训和指导，以确保安全的注射操作。 对规划失误进行调查，从而避免相同的错误再次发生。3 3、体液免疫或细胞免疫的设计考虑、体液免疫或细胞免疫的设计考虑 获得性免疫系统根据其功能分成体液免疫与细胞免疫 。 当机体受到感染时，是诱导体液免疫反应还是细胞免疫反应，主要由抗原本身以及机体免疫系统的性质所决定。机体对病原体抗原的初次免疫应答是先产生细胞应答随后产生体液应答，再次应答时根据抗原性质的不同两类应答的强弱有所不同。 4 4、疫苗设计中、疫苗设计中B B细胞、细胞、T T细胞表位的选择细胞表位的选择 有效的抗原表位抗原表位是确保疫苗免

24、疫效果最重要的一个指标，是确保设计出高效疫苗的基础。 常用的蛋白等抗原物质的表位构成方式一般有两种：由某些氨基酸残基按一定顺序连续排列组成的线状序列，称为顺序（sequential）表位或线性（线性（linearlinear）表位）表位。由分子内不连续的23个氨基酸残基或多糖分子基团折叠排列所形成的三维结构构成，称为不连续表位（构象表位构象表位，conformational）。 T T细胞表位基本上是顺序表位，而细胞表位基本上是顺序表位，而B B细胞表位既有顺序表位，细胞表位既有顺序表位，又有空间表位又有空间表位，这主要由它们的作用机理所决定：T细胞所识别的抗原是被加工并与MHC结合的抗原短肽

25、，B细胞则可直接识别抗原。 B B细胞表位的选择细胞表位的选择 B细胞线性表位定位的方法有：采用氨基酸原理的固固相肽合成技术相肽合成技术；使用合成肽定位线性B细胞表位（pinpin支持肽技术支持肽技术），定位B细胞表位。 表位中仅有4 48 8个个氨基酸残基是决定特异性所必需的，这些关键氨基酸与侧链形成相互作用的空间结构，构成BCR表位。 某些氨基酸的确更易激发抗体反应。得出以下氨基酸表位的主要组合方式： 亲水残基，通常为Glu，Gln，Asn，His，Lys，Asp。 疏水残基，通常为Phe，Leu。 其他残基取决于各自的特性，较有效的有Pro和Thr。 决定性侧链倾向性的顺序是ArgPro

26、Asp/Glu/Phe/IleLeu/Asn/Gln.模拟表位模拟表位(mimotope)(mimotope) 模拟表位：非连续表位或构象表位是以抗以抗体识别方式组装表位体识别方式组装表位，这个表位与由蛋白中获得的短肽不同，但可能形成与抗原结构近似的表位形式，这种经过设计经过设计的单链、短的合成肽称之为模拟表位。 技术步骤：构建组成肽文库肽库噬菌体展示表位肽构象限制T T细胞表位的预测、筛选、分析细胞表位的预测、筛选、分析 抗原多肽与主要组织相容性抗原复合物（MHC）形成复合物，与T细胞表面受体相互作用提供T细胞第一激活信号第一激活信号；同时抗原呈递细胞表面的其他分子与T细胞表面相应受体相作用

27、，提供第二激活信第二激活信号号，将T淋巴细胞激活。 MHC类表位是具有固定长度的序列(通常9 9个氨基个氨基酸酸)，并且与锚定氨基酸的结合基序等位基因特异性相符；而MHC类表位的长度则在12-2512-25个氨基个氨基酸酸之间，其MHC结合锚定氨基酸的基序不易分析。 传统的T细胞表位预测采用“重叠肽重叠肽”法，即在体外合成与整个蛋白抗原序列相重叠的系列多肽，进行体外细胞毒或增殖等免疫刺激能力试验，分析一定基序短肽的免疫原性，此方法虽然较为准确，但如若保障得到所有可能的覆盖T细胞表位的重叠片段，极为耗时费物。 另外一种方法是从自然感染的细胞表面MHC I或类分子中直接分离测序直接分离测序所包含的

28、来源于病原体的来源于病原体的多肽多肽，并对这种洗脱下来的肽进行质谱分析和T细胞检测，此法得到的结果最为接近天然表位。T T细胞表位的计算机预测细胞表位的计算机预测方法方法 生物学基础生物学基础 算法算法 序列模式和结构模式 氨基酸序列周期性出现的现象，具有双性o螺旋构象 AMIPHI算法 等位基因结合的基序模型 已知表位基序在整个蛋白序列中相对密度分布 立体异构算法 I类肽复合体的结构 以已知肽的晶体结构推测与之相近的序列结构 准软件包，如CHARMm进行计算预测 肽MHC结合 与已知蛋白序列折叠库进行最佳配对结合的能量预测 穿线逼近 疫苗配方设计疫苗配方设计- -输送系统和佐剂设计输送系统和

29、佐剂设计 药物传输系统药物传输系统（Drug Delivery Systems， DDS）系指人们在防治疾病的过程中所采用的各种治疗药物的不同给药形式。 传统的药物剂型有注射剂、片剂、胶囊剂、贴片、气雾剂等，目前又开发出了长效注射剂、口服长效给药系统或缓/控释制剂、经皮给药系统等一系列新的制剂及相关辅助设备。 疫苗输送系统(VDS)有黏膜VDS、缓释VDS、透皮VDS等。类类 型型主要功能主要功能人工改建的病毒体人工改建的病毒体( (流感病毒体、甲型流感病毒体、甲型肝炎病毒肝炎病毒RGSBRGSB株、类病毒颗粒株、类病毒颗粒) )增强抗体滴度，有明显的佐剂效应，比增强抗体滴度，有明显的佐剂效应

30、，比铝盐佐剂效果好，免疫持久性长，不良铝盐佐剂效果好，免疫持久性长，不良反应小反应小细菌细菌( (乳酸菌乳酸菌) )诱导黏膜诱导黏膜IgAIgA和血清和血清IgGIgG产生产生大分子多聚体大分子多聚体( (羧甲基纤维素钠、卡波羧甲基纤维素钠、卡波普、海藻酸钠、聚丙乙交酯普、海藻酸钠、聚丙乙交酯) )可诱导良好的黏膜免疫，也可增强体液可诱导良好的黏膜免疫，也可增强体液免疫和细胞免疫应答免疫和细胞免疫应答纳米颗粒聚合体纳米颗粒聚合体( (聚丙烯酰胺、聚甲基聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚22氰基丙烯酸烷基酯氰基丙烯酸烷基酯) )可促进体液免疫和细胞免疫应答可促进体液免疫和细胞免疫应答生物

31、降解微粒生物降解微粒( (聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸、聚羟基乙酸、乳酸羟基乙酸共聚物乳酸羟基乙酸共聚物) )促进体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫应促进体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫应答答植物植物( (大豆、小麦、稻米、马铃薯、西大豆、小麦、稻米、马铃薯、西红柿红柿) )促进黏膜免疫应答促进黏膜免疫应答当前常用的疫苗传递系统物质当前常用的疫苗传递系统物质 1、疫苗黏膜输送系统、疫苗黏膜输送系统 人体有三大粘膜系统三大粘膜系统：消化道、呼吸道和生殖系统。几乎所有的病毒、细菌和寄生虫都是通过感染黏膜表面致疾病的，因此研制能够引起有效粘膜免疫反应的疫苗十分必要。 口服疫苗是通过粘膜给药最常用的途径，近年来越

32、来越引起人们的注意。口服疫苗的致命弱点是胃酸对抗原的降解作用使得疫苗丢失了免疫原性，因而需要将疫苗用胶囊包裹起来，才能用于口服免疫，且口服抗原很难引起非常强的黏膜IgA抗体反应。 2 2、疫苗缓释输送系统、疫苗缓释输送系统 采用可降解材料制备的纳米粒子疫苗、脉纳米粒子疫苗、脉冲给药疫苗冲给药疫苗等制剂作为新型药物载体，其在药物输送方面具有许多优越性：可缓释药物，延长作用时间，靶向输送药物，从而显著提高疗效，降低毒副作用，提高药物稳定性。 疫苗的缓释输送系统是疫苗制剂将来发展的一个重要方向。脉冲释药系统脉冲释药系统 人体的许多生理功能和生理、生化指标，如血压，胃酸分泌，某些激素的分泌等，呈生物节

33、律的变化，一些疾病如高血压病、心绞痛、哮喘等疾病的发作也有明显的昼夜节律。对这类疾病的最佳治疗方案是能按照生理和治疗的需要定时、定量地给药。 脉冲给药制剂是按照时辰药理学原理时辰药理学原理设计的，制剂在经过一个时间滞后，于疾病即将发作之时快速、完全地释药。脉冲释药系统可选择疾病发作的重要时刻在预定时间内自可选择疾病发作的重要时刻在预定时间内自动快速释放出有效治疗剂量的药物动快速释放出有效治疗剂量的药物，从而保证疗效，减少毒副作用，同时给药次数减少，还可大大增加病人的顺应性。 制成脉冲制剂的口服药物一般在小肠或结肠释放小肠或结肠释放，可避免肝脏首过效应，提高生物利用度。由于脉冲制剂中的药物是在疾

34、病发作时才释放，故可避免机体因长期处于高浓度药物状态而产生耐药性。脉冲释药系统的制备技术脉冲释药系统的制备技术 制成定时脉冲释药系统的关键是控制脉冲释药时间，使药物在预定的时间开始释放并能迅速起效。以单次脉冲给药制剂为例，其释药曲线呈S型。根据控制脉冲释药时间方法的不同。其制备方法可分为以下5种：、利用包衣层控释利用包衣层控释：此种方法制成的脉冲释药制剂包括两个部分含活性药物成分的制剂核心（可以是片剂或微丸）和包衣层（可以是一层或多层），包衣层可阻滞药物从核心中释放，阻滞时间（即释药时间）由衣层厚度决定。 、渗透泵机制控释渗透泵机制控释：包括由包衣层的渗透性控释，此种制剂的包衣层由pH不依靠性

35、低渗透型的聚合物如聚丙烯酸树脂 EudragitRS组成，核心中含有机酸和药物。 、利用亲水凝胶溶胀产生的力利用亲水凝胶溶胀产生的力控释：胶囊囊体用水用不溶性材料包衣，而囊帽用肠溶材料包衣，装入药物，并在囊体开口处，加一栓塞。当凝胶塞暴露于肠液环境中吸收水分膨胀，膨胀后产生外推力，经过一段时滞，水凝胶塞与囊体分离，药物从囊体中快速释放 。 、利用外界刺激控释利用外界刺激控释：利用外界刺激如电和化学、温度、光、热、电磁场、超声波、微波等很轻易控制脉冲释药时间，可进行多次脉冲释药，一般需借助外置能源装置进行。 、利用体内信息利用体内信息（磁场、电磁波、pH、血浆葡萄糖浓度等）反馈机制控制药物的释放

36、：反馈机制控制药物的释放：有pH敏感型、酶底物反应、pH敏感型溶解度、竞争性结合、金属浓度等 。疫苗控释技术疫苗控释技术 通过控释技术接种疫苗，研制能在注射后一定时期内脉冲式释放疫苗抗原的注射用控释系统，可能是达到单针疫苗单针疫苗(SAV)最有希望的方法。 采用可体内降解的聚合物（如聚乳酸乙醇酸，PLGA）作为疫苗释控载体疫苗释控载体，是目前实现SAV最有效的系统。 将抗原与聚合物混合、均质，抗原包裹于PLGA微球中，进一步干燥得到微球制剂。在干燥微球再水化时，微球表面及附近的抗原就可扩散到微球周围的介质或组织中。随后抗原继续扩散出微球（持续释放）或因缺乏抗原扩散孔或通道而进入滞留期（脉冲释放

37、）。一段时间后，水催化PLGA的酯水解。形成大量抗原扩散孔并进入第二次扩散期，可与第一次扩散期分开（分阶段释放）或重叠（持续释放）。 实例：控缓释技术典范渗透泵技术图图. .现代制药硝苯地平渗透泵控释片现代制药硝苯地平渗透泵控释片( (左），口服渗透泵制剂构造左），口服渗透泵制剂构造 ( (右）右）一个含药物与具渗透活性成分的混合体形成的药锭，被具选择性渗一个含药物与具渗透活性成分的混合体形成的药锭，被具选择性渗透的半渗透膜衣包覆，再以雷射光在药物表面击穿一释药孔，当渗透透的半渗透膜衣包覆，再以雷射光在药物表面击穿一释药孔，当渗透作用发生时，水被引进含药核心锭中，药物溶解无法由半渗透膜渗出作用

38、发生时，水被引进含药核心锭中，药物溶解无法由半渗透膜渗出而被因吸水而膨胀的推进层经由释药孔推出。而被因吸水而膨胀的推进层经由释药孔推出。 3 3、疫苗透皮输送系统、疫苗透皮输送系统 透皮给药系统或经皮吸收经皮吸收制剂：是指在皮肤表面给药，使药物以恒定速率（或接近恒定速率）通过皮肤，进入体循环产生全身或局部治疗作用的新剂型。 其优点优点体现在：药物吸收不受消化道内pH、食物、转运时间等因素影响；避免肝脏首肝脏首过效应过效应；克服因吸收过快产生血药浓度过高而引起的不良反应；可持续控制给药速度，灵活给药等。 透皮给药机理透皮给药机理 皮肤给药系统中，皮肤是药物进入体内的主要屏障，研究发现只有极少数药

39、物具有优良的皮肤透过性，多数药物不易穿过人体皮肤这一有效的，选择性的屏障。 表皮特别是角质层是主要的屏障层，一旦它的保护功能丧失，大量的水溶性，非电解质分子会以上千倍的速度扩散入体循环，所以促进药物的透皮吸收主要是减少这一屏障层的阻碍。如果通过毛孔、毛囊皮脂腺，汗管等皮肤附属器进入体内，只占总量的0.1%。这种途径更适用于一些离子和大的极性分子。 大多数分子需经由细胞和细胞间的微小间隙进入体内。因此促进药物的透皮吸收也就是要采用合理方法穿过这些间隙或打乱这种致密的结构，通过皮肤表层进入深层及体循环。三、灭活疫苗三、灭活疫苗 灭活疫苗灭活疫苗是将病原微生物（细菌、病毒等）经培养增殖、灭活处理使其

40、失去感染性，但保留免疫原性所制成的生物制品。 灭活疫苗的使用现状和研究进展 疫苗灭活方法对机体免疫应答的影响 灭活疫苗的设计 灭活疫苗的制备工艺1 1、灭活疫苗的使用现状和研究进展、灭活疫苗的使用现状和研究进展 灭活疫苗的优点优点在于：灭活疫苗没有传染性活性成分，相对比较安全，制造工艺简单，容易被制成联合疫苗和多联多价疫苗；灭活疫苗性质比较稳定，易于保存和运输。 缺点缺点：在灭活过程中有可能损害或改变有效的抗原决定簇，从而降低疫苗的免疫原性；免疫维持时间短，需要多次注射；需要抗原量比较大，成本比较高；通过粘膜途径免疫效果较差。 联合疫苗联合疫苗（combined vaccine）是将不同来源的

41、抗原通过物理混合制成的一种混合制剂，包括多联疫苗和多价疫苗，多联疫苗来源于不同类型疾病的免疫原，可用以预防不同病原体引起的传染病，如百白破联合疫苗百白破联合疫苗。2 2、疫苗灭活方法对机体免疫应答的影响、疫苗灭活方法对机体免疫应答的影响 灭活方法可分为物理法物理法和化学法化学法两大类 ，遵循两条基本的原则两条基本的原则：一是确保病原体被完全灭活；二是保证疫苗有较好的免疫原性。 物理灭活方法：加热和紫外线照射灭活。 化学灭活方法：使用的灭活剂有福尔马林福尔马林、丙酮、苯酚、丙内酯丙内酯、乙烯亚胺乙烯亚胺、二二乙烯亚胺乙烯亚胺、磷酸三丁酯、乙醇、硫柳汞等。3 3、灭活疫苗的设计、灭活疫苗的设计 灭

42、活疫苗的设计总体而言可以分为细菌性疫苗细菌性疫苗设计和病毒性疫苗病毒性疫苗设计两类 。 用于制备灭活疫苗的病原微生物菌种或毒种应依照以下标准进行选择：用于制备抗原的病原体在保存和培养过程中，应具有相对稳定的生理生化特性，不容易发生变异；所选病原微生物必须具备临床致病菌的免疫原性，并在体内可引起较强的免疫保护反应；所选病原微生物必须清楚其血清型分类及地域代表性，尽量选择不同生物型和血清型的代表株；易于大规模体外培养制备。4 4、细菌性灭活疫苗和类毒素的制备工艺、细菌性灭活疫苗和类毒素的制备工艺临床病原菌株保种生物反应器中大规模培养培养基及补料液菌体上清液纯化所需组分的提取与纯化脱毒，精制精制类毒

43、素灭活疫苗组分疫苗分离病原菌分离筛选灭活病毒性灭活疫苗的制备工艺病毒性灭活疫苗的制备工艺四、减毒活疫苗四、减毒活疫苗 减毒活疫苗是指通过必要的物理化学处理物理化学处理或采用遗传特性改变等生化处理生化处理，使病原体的致病性致病性减弱或完全消失后所制备的，以活体细胞或病毒活体细胞或病毒为抗原的疫苗。 减毒活疫苗在人体内作用时间长，具有接种次数少、免疫效果强、免疫周期长等优点，接种后不仅可以促使全身免疫形成，而且可以产生局部免疫。 缺点是减毒的病原体在人体内有毒力返祖毒力返祖的潜在危险性，可能形成潜在感染或传播；疫苗中可能包含对人体不利的因子；减毒活疫苗不稳定，不易于保存和运输。1 1、减毒活疫苗的

44、使用现状与研究进展、减毒活疫苗的使用现状与研究进展 目前使用的减毒活疫苗基本是通过传统的工艺制备，然而对于一些无法培养或难以培养的病原体无法培养或难以培养的病原体如丙肝病毒和一些有潜在危险性病理作用的病原体，用传统方法难以制备。因而通过基因工程技通过基因工程技术改造和构建新型减毒活疫苗术改造和构建新型减毒活疫苗，成为新疫苗发展的一个重要方向。如HIV（Human immunodeficiency virus）疫苗和结核疫苗艾滋病减毒活疫苗艾滋病减毒活疫苗 HIV疫苗研究根据其特殊的基因进化变异基因进化变异引起病毒抗原变异进行设计。HIV nef基因突基因突变或缺失变或缺失时，病毒毒力急剧减低，

45、这为HIV活疫苗研究提供了拓展的可能。 选用对人类没有致病性的非复制型金丝雀痘病毒（VCP）为表达载体，通过重组DNA技术在VCP上插入HIV的抗原目的基因，构建成具有HIV免疫原性的载体疫苗 。Human Immunodeficiency VirusHIV-1分二型分二型HIV-2 法国巴斯德研究所 Montagnier首次分离出一株新的逆转录病毒称为淋巴腺病相关病毒LAV；年 美国Gallo等亦分离出相似的逆转录病毒，称为人类嗜T淋巴细胞病毒HTLV-；1986年国际病毒分类学会正式统一命名为年国际病毒分类学会正式统一命名为HIV分二型分二型HIV-11.形形 态态 与结与结 构构中等球形

46、颗粒（中等球形颗粒（100-120nm）核心核心 2条条 +ssRNA的二聚体的二聚体 有包膜有包膜包膜表面含有包膜表面含有gp 120 糖蛋白糖蛋白 形成刺突形成刺突 gp 41 糖蛋白糖蛋白 跨膜蛋白跨膜蛋白 ( (一一) )生物学性状生物学性状HIVHIV模型图模型图脂双层膜gp120gp41包膜糖蛋白p24衣壳蛋白p17内膜蛋白p7核衣壳蛋白逆转录酶蛋白酶整合酶 培养特性培养特性体外培养，HIV主要感染CD4+的T细胞和巨噬细胞恒河猴和黑猩猩可作为感染的动物模型，但感染过程与产生的症状和人类不同传染源与传播途径传染源与传播途径传染源：传染源：无症状无症状HIV携带者及携带者及AIDS病

47、人病人传播途径：传播途径：性接触感染性接触感染 血源性感染血源性感染 母婴垂直感染母婴垂直感染免疫损伤机制在被感染的CD4 T细胞内大量复制导致细胞死亡细胞死亡针对HIVgp120的特异性抗体和CTL攻击HIV感染的CD4T细胞而造成损伤损伤感染HIV的细胞表面表达gp120分子，可与旁邻T细胞CD4分子连接，导致细胞融合或形成多核巨细胞，加速细胞死亡细胞死亡Gp120抗原-抗体复合物与T细胞CD4分子接合诱使细胞凋亡细胞凋亡。抑制T细胞增殖和细胞因子分泌免疫应答在HIV感染过程中，机体可产生高滴度的抗HIV多种蛋白的抗体抗体，以及细胞免疫应细胞免疫应答答但HIV仍能持续地在体内活跃复制，构成

48、长时期的慢性感染状态慢性感染状态疫苗研究抗病毒治疗2005年3月12日，艾滋病疫苗在广西正式进入期人体临床试验 现在还没有非常有效的艾滋病疫苗 ！2 2、减毒活疫苗的免疫学特性、减毒活疫苗的免疫学特性 减毒活疫苗的体液免疫特征减毒活疫苗的体液免疫特征 减毒活疫苗接种后，B细胞在抗原刺激下首先分化为IgM分泌型浆细胞，最初免疫应答的抗体主要是IgM为主的免疫反应，然后B细胞分化为产IgA和IgG分泌型浆细胞，分泌的IgA和IgG抗体，可特异性清除入侵微生物。 减毒活疫苗的细胞免疫特征减毒活疫苗的细胞免疫特征 减毒活疫苗接种后，可有效激活T细胞 ，引起以T细胞介导的细胞免疫反应 。3 3、减毒活疫

49、苗的设计、减毒活疫苗的设计 不论是传统的或是新类型的减毒活疫苗，在设计、生产制备时应首先考虑疫苗的安全性安全性、免疫原性、遗传稳定性和生产适应性。 用基因工程的手段对细菌和病毒进行改造，使病原体彻底减毒，删除或改造致病基因删除或改造致病基因，或将特异性抗原基因转移到更安全的活体微更安全的活体微生物载体生物载体上，使病原体彻底减毒，遗传性能更稳定，安全性和免疫原性更平衡。 4 4、减毒活疫苗的制备技术、减毒活疫苗的制备技术病原微生物筛选纯化减毒或无毒微生物毒力恢复及安全性检测DNA重组技术：去除或改造编码毒素的基因片段，或将有效抗原基因重组至安全活载体传统技术：通过连续传代培养或变温培养逐步减毒

50、反应器或组织大规模培养分离纯化微生物疫苗五、重组疫苗五、重组疫苗 利用现代基因工程技术将有效的特异性抗原基因插入易于增殖的载体，在载体增殖时可表达有效特异性抗原，取之作为疫苗。如基因工程乙肝疫苗。 目前采用基因工程技术研制的新型疫苗主要有亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗（DNA疫苗）等， 这些疫苗统称为基因工程疫苗或重组疫苗。 1、重组亚单位疫苗、重组亚单位疫苗 提取或合成细菌或病毒外壳的特殊蛋白结构，提取或合成细菌或病毒外壳的特殊蛋白结构，即抗原决定族制成的疫苗。即抗原决定族制成的疫苗。如流脑、流感疫苗、肺如流脑、流感疫苗、肺炎疫苗等。炎疫苗等。 亚单位疫苗含几种主要表面蛋白，消除了许多无关

51、抗原亚单位疫苗含几种主要表面蛋白，消除了许多无关抗原决定族和粗制或半提纯制剂诱发的抗体，从而减少疫苗决定族和粗制或半提纯制剂诱发的抗体，从而减少疫苗副反应和疫苗引起的相关疾病。副反应和疫苗引起的相关疾病。 不足：免疫原性低，需与佐剂合用。不足：免疫原性低，需与佐剂合用。基因工程亚单位疫苗主要分为基因工程亚单位疫苗主要分为细菌性疾病亚单位细菌性疾病亚单位疫苗、病毒性疾病亚单位疫苗和激素亚单位疫疫苗、病毒性疾病亚单位疫苗和激素亚单位疫苗苗3类。类。优点优点：重组亚单位疫苗在所有疫苗中是最安全、最实用的。重组亚单位疫苗在所有疫苗中是最安全、最实用的。2、基因工程活体重组疫苗、基因工程活体重组疫苗 用

52、基因工程技术对用作疫苗的微生物（细菌或病毒）进行改造， 使非致病性微生物携带并表达某种特定病原微生物的抗原决定簇基因抗原决定簇基因，产生免疫原性，或使致病性微生物修饰或去掉编码致病性修饰或去掉编码致病性物质的基因物质的基因但仍保持免疫原性保持免疫原性，由此获得的疫苗称之为活体重组疫苗。 活体重组疫苗克服了常规疫苗的缺点，兼有灭活疫苗和减毒活疫苗的优点。 基因工程活体重组疫苗包括：基因突变疫苗及基因缺失疫苗、复制性活体重组疫苗、非复制性活体重组疫苗。 活体疫苗的优点： 活载体疫苗可同时启动机体细胞免疫和体液免疫，避免了灭活疫苗的免疫缺陷； 可以同时构成多价以至多联疫苗 疫苗用量少，免疫保护持续时

53、间长、效果好，不用添加佐剂，降低了成本； 不影响该病的监测和流行病学调查。 尽管重组活疫苗比传统减毒疫苗安全，但仍不可避免地存在“毒力回复”的可能性，病毒在不断繁殖过程中可能出现自身修复，因此重组活疫苗使用的安全性仍需慎重评价。3、重组疫苗的设计与制备、重组疫苗的设计与制备目的基因的选择与改造目的基因的选择与改造:1、致病毒素因子作为目标抗原、致病毒素因子作为目标抗原2、将机体或机体细胞上的病原体受体或病原体上相应的配体作为目标、将机体或机体细胞上的病原体受体或病原体上相应的配体作为目标抗原抗原3、同一病原体的多重抗原作为选择的目标抗原、同一病原体的多重抗原作为选择的目标抗原4、来自不同病原体

54、抗原的组合、来自不同病原体抗原的组合基因改造问题：毒力基因的删除是否完全以及是否影响疫苗的免疫原基因改造问题：毒力基因的删除是否完全以及是否影响疫苗的免疫原性、对具有潜在糖基化位点的基因通过修饰和改造使其获得糖基化以性、对具有潜在糖基化位点的基因通过修饰和改造使其获得糖基化以提高表达产物的稳定性、通过增强目的抗原基因在宿主中的表达来提提高表达产物的稳定性、通过增强目的抗原基因在宿主中的表达来提高抗原表达量。高抗原表达量。 基因工程亚单位疫苗一般具有良好的安全性，但基因工程亚单位疫苗一般具有良好的安全性，但其免疫效果一般不理想，为了增强它的免疫原性，其免疫效果一般不理想，为了增强它的免疫原性，一

55、种方法是调整基因组合使之一种方法是调整基因组合使之表达成颗粒性结构表达成颗粒性结构，例如将甲型肝炎病毒的整个编码区插入痘苗载体例如将甲型肝炎病毒的整个编码区插入痘苗载体中可表达出来类似病毒的空心颗粒；另一种是在中可表达出来类似病毒的空心颗粒；另一种是在体外加以体外加以聚团化聚团化，包入脂质体或胶囊微球中，或，包入脂质体或胶囊微球中，或加入免疫增强作用的化合物作为佐剂。加入免疫增强作用的化合物作为佐剂。 表达载体与表达系统的选择表达载体与表达系统的选择 疫苗表达系统的选择主要取决于所表达的抗原的免疫原性免疫原性、表达的效率表达的效率及产物纯化的难易程度纯化的难易程度。 HBsAg 重组腺病毒载体：依据同源重组的原理。先将外源基因插入含有必要表达元件和一定的腺病毒基因组DNA片段的表达载体中。通过一定的方法如磷酸钙方法，与另一段的病毒DNA共同转染宿主细胞；转染进宿主细胞的质粒