结肠癌根治术后腹腔热化疗对T淋巴细胞亚群及细胞因子的影响

1、结肠癌根治术后腹腔热化疗对T淋巴细胞亚群及细胞因子的影响         08-07-26 15:23:00     编辑：studa20             作者：胡敏超 方万强 余健雄 吴瑞景 付春利【摘要】  目的：探讨腹腔热化学治疗对机体细胞免疫水平的影响。方法：将135例结肠癌根治性切除术后分为A,B两组治疗。A组65例，采用卡铂、5

2、Fu以及丝裂霉素分次溶入加热至4550的生理盐水中腹腔注射；B组65例将上述化疗药物溶入常温生理盐水中腹腔注射，C组62例为健康正常对照组且未行腹腔灌注化疗。分别观察3组病例外周血T淋巴细胞亚群和细胞因子（IL4与IFN）的变化。结果：A组热化疗后15 d时，CD4+水平较术后第7天明显增加(t=2.32，P0.05)，CD8+水平明显低于B组同期水平(t=3.00，P0.05)，IL4水平较术后第7天明显下降(t=2.65，P0.05)，而IFNr水平明显增加（t=2.70，P0.05）。CD4百分比与IFNr水平正相关，CD8百分比与IL4水平正相关。结论：结肠癌根治性切除术后热化疗，在杀

3、灭肿瘤细胞的同时，可诱导机体产生抗肿瘤的细胞免疫应答。 【关键词】  结肠肿瘤 热疗；化学治疗；细胞免疫    Abstract  Objective: To investigate the effect of intraperitoneal thermochemotherapy on Tlymphocyte subsets and cytokine after radical resection of colon cancer. Methods: A total of 135 cases of colon cancer were divide

4、d into group A and B. Group A(65 cases) were treated with carboplatin, 5Fu and mitomycin which were dissolved respectively with 4550 normal saline and injected into abdomen cavity after radical resection, and Group  B were treated with above mentioned drugs which were soluted with normal saline

5、 of normal temperature and injected into the abdominal cavity after radical resection. And there were 62 cases of healthy individuals as control (group C). The level of Tlymphocyte subsets and cytokine were explored in these groups. Results: In group A at 15 day after thermochemotherapy, the level o

6、f CD4+  Tlymphocyte subsets increased significantly(t=2.32,P0.05), CD4+  Tlymphocyte subsets decreased significantly (t=3.00,P0.05), the level of IL4 decreased(t=2.65,P0.05) but IFNr increased significantly(t=2.70, P0.05). The percentage of CD4+T lymphocyte subsets was positively coherent

7、with the level of IFNr, and so was the percentage of CD8+T lymphocyte subsets with the level of IL4. Conclusion: Intraperitoneal thermochemotherapy after radical resection of colon cancer can not only eradicate disseminated tumor cells in abdomen but also induce tumorspecific cellular immunity. 

8、;   Key words   Colon neoplasm； Thermotherapy； Chemotherapy； Cellular immunity    结肠癌浸润浆膜层后往往发生肉眼或镜下的腹膜播散种植，而结肠癌的门静脉转移甚至可发生Dukes A期，结肠癌腹膜播散种植和肝转移是术后复发和转移的重要原因，即使采用D4廓清手术都不能清除潜在的癌细胞腹膜和门静脉播散15。恶性肿瘤对高温的耐受性差，热疗可促使肿瘤细胞坏死、促使肿瘤细胞相关抗原的暴露以及提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，这是腹腔热化疗的理论依据之一6, 7

9、。近年来许多研究证明，腹腔热灌注化疗能明显减少结肠癌腹腔内种植和肝转移8, 9，但是腹腔热化疗对机体免疫功能的影响国内外报道较少，我院20012006年共对65例结肠癌根治性切除术后行热化疗，观察热化疗对机体细胞免疫水平的影响，现报告如下。    1  临床资料    1.1  一般资料：本组135例，男86例，女49例，年龄2182岁，平均（51.2±7.3）岁,中位年龄52.0岁。133例为单发癌灶，2例为2个癌灶（乙状结肠和升结肠以及结肠脾曲和横结肠）。单发瘤灶部位：乙状结肠癌34例，升结肠癌26例

10、，结肠脾曲癌12例，横结肠癌22例，结肠肝曲6例，降结肠癌11例，盲肠癌22例。Dukes分期：A期6例，B期53例，C期72例，D期4例。病理类型：管状腺癌21例，乳头状腺癌37例，黏液腺癌32例，印戒细胞癌24例，未分化癌15例，鳞癌4例，腺棘皮癌2例。本组病例术前均作电子结肠镜检查，镜下活检病理提示为结肠癌。    1.2  分组：本组135例采用双盲随机抽信封的方法分为两组。热化疗组（A组）65例。常规化疗组（B组）70例。两组在性别、年龄组成、肿瘤分期以及病理类型各方面无统计学差异，资料具有可比性。另取良性结直肠疾病（结肠良性息肉、重度痔以及结

11、肠冗长综合征等）而住院的62例患者作为正常对照组（C组），入院前3月内以及住院期间，无放疗化疗过程，无严重感染过程。    1.3  治疗方法    A组患者于根治术后1周应用中心静脉穿刺设备经麦氏点处腹壁将导管置入腹腔，穿刺成功后滴注500 mL生理盐水2 h无特殊不适后，将化疗药物溶入生理盐水500 mL中，加热至4550，直接进行腹腔热灌注，1次/d×5 d为1个疗程。第1天灌注卡铂（200 mg/m2），第2天灌注5Fu（400 mg/m2），第3天灌注丝裂霉素(MMC，5 mg/m2），第4天灌注5Fu

12、1（400 mg/m2），第5天灌注MMC(5 mg/m2）8,10。B组患者于根治术后1周将化疗药物溶入生理盐水500 mL中，腹腔穿刺以及化疗药物的方案同A组。C组根据原发疾病进行相应的专科治疗。    1.4  监测方法    FITC和PE标记的鼠抗人CD4+和CD8+单克隆抗体购自EB公司，采用流式细胞仪监测患者外周血T淋巴细胞亚群的变化，IL4和IFN的酶联免疫吸附（ELISA)，检测试剂盒购自EB公司，监测患者治疗前后血清细胞因子水平的变化。    A组和B组于手术后第7天、化疗完

13、成后第7天和第15天后空腹抽血，C组患者于入院后第1天空腹抽血，标本留取方法同A组和B组。    无菌取空腹静脉血5 mL，肝素抗凝处理，1000 r/min离心5 min，取下层细胞团，细胞团内培养液少于25 l，送流式细胞学检查T淋巴细胞亚群。步骤：加入FITC和PE标记的CD4+、CD8+表面分子的单克隆抗体15 l，混合均匀，4下避光反应30 min。PBS洗涤2次后，弃上清，加入1 mL的1%甲醛，固定30 min。加样枪将荧光标记抗体结合的细胞加入BeckmanCoulter流式细胞仪的检测孔内，检测淋巴细胞CD4+和CD8+表面分子的表达以了解外周血

14、内T淋巴细胞亚群的变化情况11。数据以表达率的95%可信区间作为衡量表达情况的标准。    其余上清再次4000 r/min离心5min，吸取上清，-20冻存，标本满24个时ELISA方法监测IL4和IFN。步骤：用俘获抗体包被96孔板，4孵化过夜。吸干孔内液体，每孔加300 L洗涤液，共洗涤3次。每孔加200 L的Assay Diluent封闭，室温下孵化1 h。吸干封闭液后洗涤板孔。除空白孔外，分别将不同浓度（2倍连续稀释）标准品、待测血清加入相应的反应孔中（100 L/孔），每个标本设3个复孔。用封板胶纸封住反应孔，置37孵箱孵育2 h。重复吸干、洗涤板孔5

15、次。除空白孔外，每孔加入抗体工作液100 L，用封板胶纸封住反应孔，置室温孵育1 h。重复吸干、洗涤板孔5次。除空白孔外，每孔加入酶结合物工作液100 L，用封板胶纸封住反应孔，置室温下孵箱孵育30 min。重复吸干、洗涤板孔7次。每孔加底物溶液100 L，室温下孵箱孵育15 min。每孔加终止液50 L。反应完毕后，即刻在酶标仪上读取样本孔及标准品孔的OD450nm值和OD570nm值，以二者差值和对应的细胞因子浓度的常用对数值，分别作纵、横坐标，绘制标准曲线，从标准曲线求出样本的细胞因子浓度12。    1.5  统计学处理：3组患者的计量资料的描述

16、采用均数±标准差（±s），采用单因素方差分析进行统计学比较，组间均数比较应用独立t检验进行比较，非正态分布计数资料组间比较用MannWhitney U检验，淋巴细胞亚群和细胞因子之间的关系采用Spearman相关分析，设定为0.05。所有数据均在计算机SPSS13.0统计软件上进行运算。    2  结  果    2.1  T淋巴细胞亚群变化：见表1。    经单因素方差分析，3组患者的CD4以及CD8变化存在统计学差异经独立样本的t检验，A组和B组术后

17、第7天以及化疗后第7天的CD4低于C组（t=1.86，P<0.05；t=2.02，P<0.05）；而A组和B组之间于术后第7天以及化疗后第7天无明显差别（t=1.50，P0.05；t=1.42，P0.05），和B组化疗后15 d相比较，A组热化疗后15 d的CD4+明显增加(t=2.60，P<0.05)；经配对t检验，A组热化疗后15 d的CD4+水平较术后第7天以及化疗后第7天明显增加(t=2.32，P<0.05)。    经配对t检验，A组患者热化疗后15天的CD8+水平较术后第7天以及化疗后第7天明显下降（t=2.46，P<0.

18、05；t=1.99，P<0.05；）；B组患者化疗后15 d的CD8+水平较术后第7天以及化疗后第7天有所增加，但未达到统计学差异（t=1.12，P0.05；t=1.33，P0.05），经独立样本的t检验，A组患者化疗后15 d的CD8+水平和C组无明显差别（t=1.28，P0.05），B组患者化疗后15 d的CD8+水平明显高于A组同期水平(t=3.00，P<0.05)。表1  3组患者淋巴细胞亚群变化    2.3  外周血IL4和IFNr水平变化：见表2。    经单因素方差分析，3组患者外周血IL4和IFNr水平变化