链脲菌素诱导型糖尿病猪主动脉内膜炎症因子的检测_图文

1、上海交通大学学报(医学版Vol .28No .3Mar .2008Journal of Shanghai J iaotong University (Medical Science 基金项目:上海市自然科学基金(028610(Nature Science Foundati on of Shanghai,028610。作者简介:陈秋静(1982-,女,上海人,初级技师,学士;电子信箱:cqjfj yahoo 。通讯作者:沈卫峰,电子信箱:rjshenweifeng yahoo 。文章编号:0258-5898(200803-0289-05论著链脲菌素诱导型糖尿病猪主动脉内膜炎症因子的检测陈秋静,陆

2、林,张奇,蒲里津,彭文辉,闫小响,王玲洁,沈卫峰(上海交通大学医学院瑞金医院心内科,上海200025摘要:目的运用链脲菌素(STZ 诱导制作中国贵州小型猪糖尿病模型,检测主动脉血管壁炎症因子水平,评估模型的血管病变。方法20头中国贵州小型猪分成STZ 诱导型糖尿病组(n =10:使用125mg/kg STZ 诱导致病;正常对照组(n =10:注射等量柠檬酸钠溶液。两组分别在制模前和制模1个月后进行了口服葡萄糖耐量试验(OGTT ;并于制模前和制模6个月后检测肝肾功能、血脂和外周血白细胞计数。采用免疫组化法检测胰岛细胞;W estern bl otting 法检测主动脉内膜组织培养液中T NF

3、2浓度;RT 2PCR 法测定主动脉内膜T NF 2、I L 21、I L 26mRNA 水平。结果制模前后两组血清生化指标(除空腹血糖外无统计学差异(P >0.05。糖尿病组在诱导后1个月的空腹血糖和餐后2h 血糖水平均显著高于诱导前水平(P <0.001。糖尿病组胰腺胰岛细胞几乎消失,组织培养液中T NF 2水平较对照组显著上调(P <0.001,主动脉内膜组织中T NF 2、I L 21和I L 26mRNA 水平也较对照组显著增高(P <0.05。结论用STZ 诱导成功建立了中国贵州小型猪糖尿病模型,糖尿病猪的主动脉管壁内炎症因子水平增高,动脉粥样硬化进展。关键

4、词:糖尿病;链脲菌素;肿瘤坏死因子-;白介素-1;白介素-6中图分类号:R 587.1;R 543.12;R 2332文献标志码:AAna lysis of i n flamma tory cytok i n es i n aortic i n tima of p igs w ith streptozotoc i n 2i n duced d i a betesCHEN Q iu 2jing,LU L in,ZHANG Q i,P U L i 2jin,PENG W en 2hui,Y AN Xiao 2xiang,WANG L ing 2jie,SHEN W ei 2feng(Depart

5、m ent of Cardiology,Ruijin Hospital,School of M edicine,Shanghai J iaotong U niversity,Shanghai 200025,China Abstract:O bjective To analyze the infla mmatory cytokines in aortic wall in Chinese Guizhou mini p igs with strep t oz otocin (STZ 2induced diabetes .M ethods T wenty Chinese Guizhou minip i

6、gs were divided int o STZ (125mg/kg 2induced diabetic gr oup (n =10and contr ol gr oup (by injecti on of sa me a mount of s odiu m citrate,n =10.Oral glucose t olerance test (OGTT was perfor med before and one month after STZ ad ministration .L iver and renal function,bl ood lip ids and peripheral w

7、hite bl ood cell count were evaluated at baseline and 6months after STZ inducti on .Pancreas was exa minedi mmunohist oche mically for islet cells .Aortic inti ma of diabetic mini p igs and contr ols was analyzed for T NF 2level in tissue conditioned mediu m by Western bl otting .T NF 2,I L 21and I

8、L 26mRNA levels in aortic inti ma were assayed by reversetranscrip tion poly merase chain reacti on (RT 2PCR .Resu lts There were no significant changes in bioche mical para meters before and after the model establish ment in both gr oup s (P >0.05,excep t fasting glucose .Significant elevation i

9、n fasting glucose and 22hour post p randial glucose levels was observed one month after STZ inducti on (P <0.001.Pancreatic islet cells in diabetic mini p igs had al m ost disappeared .There was dra matically increased T NF 2level in aotic inti ma conditi oned mediu m (P <0.001,and significant

10、 elevation of T NF 2,I L 21and I L 26mRNA levels was revealed (P <0.05.Conclusion The p resent study has established Chinese Guizhou m ini p ig models with STZ 2induced diabetes .I nflammat orycyt okines significantly elevate in aortic inti ma of diabetic m ini p igs,indicating the devel opment o

11、f ather osclerosis .Key words:diabetes mellitus;strep tozot ocin;tu mor necrosis factor 2;interleukin 21;interleukin 26糖尿病慢性血管并发症,如冠心病、脑卒中和肾功能受损是造成糖尿病患者住院和死亡的主要原因1。大量的体内和体外实验2-5表明,糖尿病动脉粥样硬化发展迅速,其机制与血管壁的炎症加剧密切相关。动物模型很早就被用于糖尿病研究6-7。近年来,大动物的糖尿病模型因更接近于人类糖尿病及其并发症的病理生理,并在心血管并发症的临床检982上海交通大学学报(医学版Vol.28查技术

12、上具有可操作性而被较多采用8-11。迄今已有多种诱导糖尿病的实验方法被尝试,胰腺切除是制作模型的方法之一,缺点是术后感染导致高死亡率。研究12-14显示一些化学毒性物质可以破坏胰岛细胞,但不损害其他内分泌细胞。链脲菌素(strep t oz ot ocin,STZ能干扰葡萄糖转运和葡萄糖激酶功能而使DNA链断裂。单次或重复多次注射STZ 使猪胰岛细胞受损,造成类似1型糖尿病的表现15-16,空腹血糖明显升高,胰岛素分泌显著受损17。尼克酰胺是一种细胞膜稳定剂,与STZ联合使用可以造成空腹血糖轻度升高、胰岛素持续分泌减少的糖尿病模型10。本研究尝试运用中国贵州小型猪建立STZ诱导型糖尿病模型,并

13、评估其主动脉炎症因子的水平。1材料与方法1.1动物中国贵州小型猪20头,雄性,46月龄,体质量2030kg,购自上海交通大学农学院,饲养于交通大学医学院实验动物科学部。饲养环境温度控制在1825,有持续的空气交换。饲料(15%蛋白质+50%碳水化合物+5%脂肪购自上海饲料厂,每天喂食2次,饮水不限。1.2建立STZ诱导的糖尿病模型小型猪分成两组:用STZ诱导的糖尿病组(n=10,125mg/kg STZ (S0130,Sig ma,美国溶于柠檬酸钠溶液(pH4.7中静脉注射;正常对照组(n=10静脉注射等量柠檬酸钠溶液,注射后密切监测两组的血糖浓度。注射STZ后第3或4天,用快速稳步血糖仪(J

14、ohns on&Johns on,美国检测到血糖水平升高后持续使用胰岛素治疗,维持空腹血糖水平在10mmol/L以下。1.3检测方法1.3.1生化检测:两组分别在制模前和制模6个月后收集血样本,检测血清葡萄糖、丙氨酸氨基转移酶(ALT、天冬氨酸氨基转移酶(AST、白蛋白、总蛋白、总胆固醇(TC、甘油三酯(TG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL2C、高密度脂蛋白胆固醇(HDL2C、脂蛋白aLP(a、载脂蛋白A(apoA、载脂蛋白B (apoB、尿素氮(BUN和肌酐。1.3.2口服葡萄糖耐量试验(oral glucose t olerance test,OGTT:两组分别在制模前1周和制模1个月

15、后进行OGTT。动物禁食12h后,喂食25g饲料+2g/ kg葡萄糖7,在OGTT前10(-10m in及0、30、60、90、120m in时经静脉留置套管中抽取血样,检测血糖水平。1.3.3免疫组化检测:两组动物均于制模6个月后处死。分离并取胰腺和主动脉壁组织,中性福尔马林中固定。组织用石蜡包埋,R M2165显微镜薄片切片机切片(3m。胰腺组织经石蜡块脱蜡,过氧化氢处理后血清封闭。抗猪胰岛素(sc28033,Santa Cruz,美国或抗人肿瘤坏死因子(T NF2(sc28301, Santa Cruz,美国;经向公司咨询了解到该抗体也与猪T NF2存在交叉反应的一抗以1100稀释,孵育

16、过夜。阴性对照第一抗体由P BS取代。使用辣根过氧化物酶耦联的二抗和二氨基联苯胺(dia m i onben zi2 dene,DAB(DAK O,丹麦显色。1.3.4逆转录-多聚酶链反应(reverse trancri p ti on poly merase chain reacti on,RT2PCR法测定炎症因子信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA水平:采用试剂盒(Q iagen,美国抽提糖尿病组主动脉管壁组织总RNA,并进行定量测定。通过逆转录和RT2PCR对T NF2、白介素-1(interleukin21,I L2 1和白介素-6(I L26

17、mRNA扩增。T NF2引物:上游52ggctgtacctcatctactcc23,下游52cagcaaagtccagat agtcg23;I L21引物:上游52gatgaggagtatgagagcga23,下游52gacaggcttatgttctgcttg23;I L26引物:上游52 gtgagaagtatgagaagtgtga23,下游52gcaggatgagaatgatctttg2 3。以磷酸甘油醛脱氢酶(G AP DH为内参:上游52 acgaccatggagaaggctg23,下游52tcgtacgaggaaatgagct23。1.3.5免疫印迹法(W estern bl ott

18、ing检测:取主动脉内膜组织,剪碎后浸泡于RP M I培养液添加1%牛血清白蛋白(bovine serum album in,BS A和2%羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES中,37、5%CO2的无菌条件下培养24h,收集组织培养液。把组织培养液中的蛋白定量后进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(s odium dodecyl sulfate polyacryla m ide gel electr opheresis,S DS2P AGE,并将分离蛋白转移到聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride,P VDF膜上(M illi pore,美国。用立春红染色证实电泳各泳道上样量相

19、等,将膜在抗T NF2抗体中孵育过夜,次日经辣根过氧化物酶耦联的二抗作用后,用增强化学发光(enhanced che m ilu m inescence,ECL法(Amersha mB i osciences,美国显影检测。1.4统计学处理所有数据都用x±s表示。糖尿病组和对照组的血清生化指标比较采用SPSS13.092No .3陈秋静,等:链脲菌素诱导型糖尿病猪主动脉内膜炎症因子的检测软件进行配对和非配对t 检验。P <0.05表示有统计学差异。2结果2.1模型建立和生化检测两组制模前年龄和体 质量比较无统计学差异(P >0.05,但制模6个月后糖尿病组体质量明显低于对

20、照组(P <0.01。两组制模前后血清TC 、TG 、HDL 2C 、LDL 2C 、LP (a 、apoA 、apoB 、BUN 、肌酐、ALT 、AST 、总蛋白和白蛋白均无明显改变,血白细胞计数也无明显变化(P >0.05。糖尿病组STZ 诱导后2d 空腹和餐后血糖都明显升高,空腹血糖由STZ 诱导前的(2.66±0.57mmol/L 上升至1个月时的(8.00±3.06mmol/L 和6个月时的(7.10±4.21mmol/L (P <0.001;损伤后第1个月内,每天需胰岛素1020U 将血糖控制于10mmol/L 以下;23个月后,空

21、腹血糖水平逐渐下降,为维持实验所需的高血糖状态,逐渐减少胰岛素用量。2.2空腹血糖和餐后2h 血糖水平的变化糖尿病组空腹血糖水平由制模前1周的(2.5±1.7mmol/L 升高至制模1个月后的(7.5±3.2mmol/L (P <0.001;餐后2h 血糖也由制模前的(3.2±1.7mmol/L升高至制模后的(16.7±4.8mmol/L (P <0.001(图1。对照组注射柠檬酸钠前1周和1个月后的空腹血糖为(2.4±1.0mmol/L 和(2.5±0.8mmol/L;餐后2h 血糖为(3.1±1.0mmol/

22、L 和(3.0±1.1mmol/L,前后比较均无明显差异(P >0.05。图1糖尿病组STZ 诱导前后空腹血糖和餐后2h 血糖水平的变化F i g 1Fa sti n g and 2h postprand i a l glucose levels i n d i a beti c groupbefore and after STZ i n ducti onP <0.001vs one week before STZ inducti on2.3胰腺组织中胰岛细胞的检测对照组胰腺中存在大或中等不规则的胰岛,也有散在分布的胰岛细胞;而空腹血糖水平持续高于10mmol/L 的糖尿

23、病组胰岛细胞几乎完全消失(图2。STZ 诱导23个月后,糖尿病组动物胰腺组织中发现有残留的小部分胰岛细胞。 图2糖尿病组(诱导后6个月和对照组胰腺胰岛的免疫组化检测结果F i g 2I mm unoh istochem istry result of pancrea s for d i a beti c group (si x m on thes after STZ i n ducti onand con trol group A:pancreas of contr ol gr oup ×10;B:pancreas of contr ol gr oup ×100;C:pan

24、creas of diabetic gr oup ×10;D:negative contr ol ×10192上海交通大学学报(医学版Vol .282.4主动脉血管壁炎症因子的表达组织培养液的W estern bl otting 检测结果显示,糖尿病组灰度值18.5±3.8,正常对照组灰度值4.1±1.5,表明糖尿病猪主动脉内膜的T NF 2水平显著升高(P <0.001。血管壁的免疫组化检测也证实了这一结果(图3。RT 2PCR 结果表明糖尿病猪主动脉内膜的T NF 2、I L 21和I L 26mRNA 水平较之对照组显著升高(图4,灰度值分别

25、为(4.1±0.6vs (3.0±0.4、(4.5±0.8vs (3.4±0.5、(2.6±0.5vs (1.7±0.2(P <0.05,说明糖尿病猪主动脉内膜炎症因子表达显著增多。 3讨论 以往的研究表明,Yucatan 和Gottingen 小型猪适合用作糖尿病大动物模型9,11,17-18,给予尼克酰胺能对抗STZ 的致糖尿病作用10。使用这些模型,避免了用切除胰腺组织制作模型的效果不稳定,并且细菌毒素STZ 也不会在体内造成长时间的炎症状态而干扰实验。本研究运用中国贵州小型猪成功建立了STZ 诱导型糖尿病模型,为后续血管

26、生物学研究奠定了基础。本研究发现对照组和糖尿病组术前空腹血糖低于人类,这可能与饲养条件中不限制饮水有关。本研究中,起初对小型猪联合使用了推荐剂量的125mg/kg STZ 和67mg/kg 尼克酰胺来诱导糖尿病10,结果尼克酰胺似乎起到了很好的保护作用,没有引起明显的空腹和餐后高血糖;另外,为获得典型的1型糖尿病模型,还尝试过更大剂量的STZ (137.5mg/kg,1.1倍的常用剂量,模型猪表现出典型的脆性糖尿病症状,血糖很难控制。因此,本研究认为125mg/kg STZ 是制作贵州小型猪糖尿病模型较为合适的剂量。一般在使用STZ 68h 后出现明显低血糖。这个现象是由于毒素损伤胰岛细胞,造

27、成大量胰岛素释放,需要静脉注射高浓度葡萄糖并添加饲料来纠正低血糖。空腹血糖值、OGTT 和免疫组化检测都证实了贵州糖尿病小型猪的胰岛细胞功能明显受损。另外,因糖尿病模型猪必须接受胰岛素治疗控制血糖,而正常对照组无相应处理,所以模型猪病理组织学方面改变可能与外源性胰岛素有关。本研究显示,糖尿病猪主动脉血管壁T NF 2、I L 21、I L 26mRNA 水平明显升高,主动脉组织分泌液中T NF 2mRNA 较对照组显著增高,与人类的动脉粥样硬化病理生理过程一致19-20,表明血管壁的炎症因子受到高血糖、氧化应激和晚期糖基化终产物的影响而明显上调,进一步证实糖尿病是致动脉粥样硬化独立的危险因素。

28、目前,还没有类似于人2型糖尿病的大动物模型。有研究9显示给猪高脂和高糖饮食能够升高其血糖和血脂水平,但升高程度远不如STZ 诱导型糖尿病模型,模型建立1年后动物的主动脉并无明显292No.3陈秋静,等:链脲菌素诱导型糖尿病猪主动脉内膜炎症因子的检测的粥样斑块。用STZ诱导的糖尿病猪在病理生理学上更类似于1型糖尿病,考虑到1型和2型糖尿病在血管并发症发生中存在着共性,STZ诱导型贵州小型猪不失为探讨糖尿病血管并发症的一种模型。本研究中STZ诱导后6个月,模型猪主动脉血管炎症因子水平增高也证实了此观点。参考文献:1L i CJ,Gao RL,Yang YJ,et al.The influence

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