裸鼠荷瘤方法及注意事项(共13页)

1、精选优质文档-倾情为你奉上关于肿瘤细胞株的选择，确实是一个很麻烦的问题，各类文献中提到过的细胞株有很多，但是一般而言，我觉得，对于我们做裸鼠肿瘤模型，细胞株的选择应该考虑一下几个方面：1. 国际公认度，虽然SFDA的指导原则上表示只要是建株细胞株均可以，但是一般来说，还是应该尽量考虑国际上比较公认的细胞株。2. 体内生长情况，很多细胞株，在文献中有很高的出镜率，但是实际上，基本都是从体外开始有名，所以很多人就硬生生的往体内套，结果就是吃力不讨好，比如楼主提到的A549，还有MCF-7，都是很有名气的细胞株，但是在体内却不是一个好的试验对象，成瘤率低，生长慢，均一度差。现在国内的很多研发单位，特

2、别是一些公司的领导们，缺乏这方面的认识，动不动就把这些著名的细胞株挂在嘴边，硬压着一线的研究人员去花功夫做这些细胞株，作的不好，就怀疑大家的水平如何如何的，奶奶的，对此非常生气！3. 药物的敏感性，这一点常常被大家忽视，大部分的裸鼠肿瘤模型都是为抗肿瘤药物的筛选以及研究服务的，但是常常大家只考虑了这个细胞株是不是好做，但是没有考虑到细胞株本身对于药物的敏感性，比如Lovo细胞，国际公认度也还可以，体内生长情况也很棒，但是对于药物的敏感性不佳，大部分的常规化疗药物到了它这里，抑瘤率都会下降，显而易见，对于抗肿瘤药物的筛选来说，它不是一个好的选择。另外说一点，体内与体外的关系，现在做体内的人，常常

3、被体外的人牵着鼻子走，体外做出来什么什么细胞株敏感，体内的人就得吭哧吭哧的去做这个，但是却死活做不好，其实，现在我和一些老前辈们的观点是，体内和体外应该协调好细胞株的选择问题，体外的人手上有大把的细胞株可以选择，如果，体内的人不去和他们协调，那么将永远被牵着鼻子走，受累还不讨好，应该大家坐下来，一起选择2030种细胞株作为常规的筛选细胞株，这就足够了，细胞株选择的时候考虑好方向（胃癌、肝癌、肺癌什么的）、靶点（EGF、vEGF等等），不能漫无边际的抓着哪个体内就的做哪个，谁也没有这个本事啊。以下给出一些细胞株供大家参考：头颈部肿瘤没有特别好的细胞株，Hep2（喉癌）、CNE（鼻咽癌）凑活，比较

4、慢，但是可以接受。肺癌不要和我提什么A549，不好伺候，NCI-H460（大细胞肺癌）还不错，生长速度快，成瘤率好，但是技术不好的话，均一度会差一些，水平过关的话，开始试验的时候SD应该为平均值的1/3，对药物很敏感，特别是紫杉醇，非常敏感。SPC-A-1（肺腺癌），马马虎虎过得去，速度不是很快，但是也还能接受。胃癌MNK-45，日本细胞株，公认度也可以，比较好。BGC-823，很好的公认度，生长有些慢。食道癌Eca-109，我们找不到其他的东西，只能用它，一般般，有点不好伺候。前列腺癌PC-3、DU-145，都是不错的细胞株，用它们没错的。结肠癌HT-29吧，生长还可以，Lovo对药物的敏感

5、性差了点。肝癌这个是比较头痛的一个领域，Bel-7402，SMMC7721只能说凑活，还有国内自己建株的QGY生长特性不错，但是公认度差了点。白血病我自己都没有做出来过，嘿嘿，K562和HL60都不好整。表皮癌A431，这家伙，棒极了，在我手上，每次试验只需要淘汰一两只，剩下的SD小于平均值的1/4，我很喜欢它，主要是EGFR高表达，做这方面的药物，少不了它！乳腺癌不要用MCF-7,MDA-MB-435、MDA-MB-468、Bcap-37都不错，其中Bcap-37也是EGFR高表达。卵巢癌SK-ov-3不错的。宫颈癌比较麻烦，Hela细胞株自身的生长特性就不佳，另外安全性方面也很不好，女生勿

6、近，我们以前做过一个C33A，还可以，对药物很敏感，生长比较慢，成瘤率也偏差，用的人也不多，但是没有办法阿。想起来的就这些，剩下的大家补充吧。二、1.裸鼠的状态裸鼠的年龄，比如5-7比9容易成瘤，因为这时免疫系统不够强；或者如果裸鼠由于试验系统染菌而长毛或感染，则成瘤率可能会受影响2.细胞接种量动物肿瘤一般接种2600万/只就100%成瘤，而人癌则需要1000万以上才能较高的成瘤3.细胞状态肿瘤细胞的活力，生长状态，是否对数生长期，有无污染也对成瘤影响很大三、接种量 要查文献来确定接种量，在找不到任何相关资料的情况下，最高就用到1*107/0.2ml/site,再高也没有意义了。如果

7、你的细胞很小，1*107/0.1ml也可以操作，不至于很粘稠，那么最好是1*107/0.1ml/site。查文献看他们的构建条件是什么样的，比如培养条件，接种量，接种位置什么的，是不是一定要用雌性鼠等等。      有的瘤株也有可能很容易成瘤，而且生长速度很快。建议用几只动物试试不同的接种浓度，万一能够长出来，而且还长得很快，那你就要根据情况选择一个合适的浓度了。基本上一般认为比较合适的接种浓度有这么几个特征：1. 接种后10到15天左右可以开始试验。2. 开始试验时可以用于试验的动物数不少于6070%，而且SD不

8、大于平均值的1/3左右。3. 开始试验三、四周后肿瘤重量大于1g，并且没有溃烂。当然，这些条件都是锦上添花的东西，如果以1*107/site都勉勉强强长出肿瘤，那么就不必过多的去考虑它了。 接种部位 接种部位:腋窝中部外侧皮下为好。皮下肿瘤模型中，想要成瘤率高就接种在腋下。接种时由裸鼠体侧腰部稍靠上的部位进针，要保证与接种点的距离小于针头的长度，向头部方穿行，绝对不能刺破皮肤或者刺破肌肉层，当针头到达接种位点时注射，退出针头，这样操作的目的并不完全是避免漏液，其实熟练后，不需要皮下穿行也不会漏液，主要是避免污染，进针点还有少量污染的可能性的，针头在皮下穿行一段后，

9、接种点离进针点较远，最大限度减少污染的可能。如果是用于正式实验，那么一只老鼠就只能接种一个位点，不可以接种多个位点用于保证可用的模型数。因为在有些情况下，一个老鼠身上有多于一个肿瘤的情况下，会有相互影响的可能，无论这几个肿瘤相距有多远。要是想多打几个部位做做预试验，倒也不是不可以，但是我觉得，基本上没有什么必要。  皮肤不用绷得太紧，平展就可以了，另外接种的时候进针点很靠下，针头在皮下走一段再注射，速度不要太快。注射前针头稍微动一动，能动就说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内。一般来说都是有鼓包的但是要是你接种位置太深入腋窝，你是看不到鼓包的。主要靠针头稍微动一动来判断。&

10、#160;是否应用免疫抑制剂 裸鼠皮下种瘤后，可以通过应用免疫抑制剂，比如环磷酰胺（2mg每只，打两天）来加速瘤体的生长，当然我知道裸鼠是T免疫缺陷动物，但是人家说的CTX可以进一步抑制裸鼠的体液免疫和NK细胞杀伤的保护作用，可以加快瘤子的生长，这样造模的周期很短，也可以进行人为的控制，不知道这个观点是不是有道理，实践中是不是真有人这么做呢？ 楼上说的文献中也有报道，而且还有预先用放射照射抑制动物免疫功能再接种的方法，但是一般常规应用中大多数时候不推荐这么做。另外还有一个问题应该被考虑到，大家现在都在琢磨着怎么让肿瘤出瘤的更快，造模周期更短，但是如果人为的把肿瘤生长加速，其

11、实对实验并不好。因为造模周期短，很可能生长速度也会被加快，肿瘤可能很快就溃烂了，这样就不得不被迫中止实验，而用药却没有用到足够的时间，药效还没有发挥出来就结束了，这样是很不利的。所以一般情况下，应该尽量的复合这个瘤株本身的生长特性，不应该过多地去加以人为的干扰。  是否用手术标本荷瘤 如果是药效试验，不建议用手术标本，因为SFDA的临床前研究指导原则上明确指出要用建株的肿瘤株进行试验，因为用手术标本的试验可重复性太差，你这个标本万一没有保存好，断掉了，你自己都很难重复出上次的试验结果。国外的文献上看到的却很少有人用手术标本构建模型进行试验。取材的部位：肿瘤生长活跃

12、，状态良好，结缔组织比较少的地方。运送途径：无菌、冰浴保温，无菌培养液浸泡，时间不能超过1个小时。最好一个小时内就能够接种到动物体内。接种部位：腋下。另外，手术标本还有一个风险：你不能保证取得的标本一定能够顺利地成瘤并且用于试验。 注意事项 A裸鼠的周龄,B肿瘤细胞:何种肿瘤,接种细胞的数量(用对数生长期的,活力高的)记数要准确,C接种方式:注意不要漏液,否则会损失细胞数量D饲养环境:要求是SPF条件  具体操作 1.能不能成瘤，首先要考虑你的肿瘤细胞系能否成瘤，其次关键是你的肿瘤细胞数，一般肿瘤细胞存活力还是蛮高的，所以你重点要考虑细胞数的问

13、题，但最高不要超过1*107。 2.接种时间，最好在1小时之内完成。但在我实际操作过程中，裸鼠的数量又多，1小时之内根本做不完的，所以你可以预先将细胞放在冰盒里暂为保存。效果还是不错的。 3.成瘤时间，每个肿瘤细胞不太一样，细胞数合适，一般一周左右应该能出来了；另外，如果你是打皮下，你要考虑是否有打到深层组织，比如肌肉，那即使成瘤了，也不大好摸出来。  腹腔注射 1、腹腔注射进针的位置在腹中线与小鼠两后肢上沿连交叉以下的位置。 2、腹腔注射很少会打到肠管，因为肠子在碰到硬物时会缩起来，当然前提是你的进针不是特别深，如果你的整个针头都扎

14、入了腹腔，那么肠子是无处可躲了。 3、腹腔注射进针后，你可以将针头左右摆动一下，如果是正确的，这时会有一种很自由无障碍的感觉，进针角度撑握在小于45度，针头进入长度不超过3厘米左右。 用大、小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推 0.51.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液（图2-5），为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。若实验动物为家兔，进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处肿瘤倍增时间 肿瘤动物实验模型肿瘤的倍增时间（doubling time），应

15、该是在瘤体积100800之间计算，但是一组动物有10只，每周测量2次瘤体积，如果我想计算从200倍增到400的时间的话，10只动物不会在我测量体积的时候正好到200或400，那么，在计算的时候，具体应该怎么做？ Geddes 等29将结节倍增时间的计算公式表示为：DT =（ln 2 t）/ln（V2/V1），V1、V2分别是前后两次测量的体积， t是两次测量的时间间隔 你的问题有歧义，我觉得可以有几下几种理解： 1.测量的时候，对于某个老鼠来说，第一次可能测出来的体积是189.26（不是正好200），第二次是415

16、.31（不是正好400），对于其他的动物都有这样的问题，  2.对于十只老鼠来说，测量的时候，可能1号老鼠是189.26，2号是312.57，3号是110.89.，这也是一种理解，我的意见是：测量一段比较长的时间，每只老鼠可以独立计算倍增时间，然后计算平均值，SD等，用统计学处理的手段。 个体差异      同一批种几十只老鼠，有的就长不出来，有的长得很大，使评价药效很困难。排除接种悬液未摇匀的可能后，还有什么原因可能造成这一点？可能是是个体差异了。其中，老鼠年龄是一个很大的因素。本人就遇到过2个月的老鼠

17、接种肿瘤以后，有的长有的不长的情况。如果控制好试验条件，动物也比较均一的话，一般肿瘤生长都会很好的控制在一定范围的 肿瘤模型新药申报 zym做的肿瘤模型实验是用于新药申报用,现在有一些问题还不能校准,我做的是人癌模型,实验动物为裸鼠. 1. 新药报批中,有明确的要求说肿瘤来源必须是体内传代3次以上吗? 2. 实验结束后,对于取出肿瘤块的质量有没有明确的规定呢?还是跟其他种鼠一样,要求平均瘤重不小于1g或者不大于20%的瘤快质量不小于400mg, 3. 实验评价指标相对肿瘤增殖率T/C(%),指的是瘤体积比还是瘤质量

18、比? 4. 实验申报材料是否需要附属实验动物裸鼠的照片?若需要附属的话,照片没有没有什么要求怎么照的，是鼠活的时候的照片还是实验结束后处死鼠后在摆好位置照? 5. 申报材料中附图要求是肿瘤的生长曲线还是不同时间测量的T/C值对时间所做的曲线?还是两个都要有呢? 6. 实验分组分5组,空白溶剂对照组,药物高中低三个剂量组,阳性药物有效浓度对照组. 这样可以吗?要是不可以,还需要怎么分呢? 7. 实验材料中是否需要包含该实验动物血液相关指标的数值呢?比如:白细胞数量,骨髓的影响等等 8. 

19、一次实验有效后,是不是也需要重复实验三次?那三次的数据都需要包含在数据中吗? swordzjsh具体问题回答如下： 1.没有问题，新老原则均明确要求体内三代以上，并且不能超过1520代（人肿瘤）。 2. 新原则已经没有瘤重的指标，只考察瘤体积，也没有对试验结束后的肿瘤大小有明确要求，但是老的指导原则有这方面的要求。 3. 新的原则是指瘤体积，老的指瘤重，实际上在数据处理的时候一般瘤体积和瘤重的数据都会加入，分别计算相应的T/C。 4. 需要，常见的有两种：一种是处死后摆放并拍摄整鼠照片，还有一种是剥取肿瘤后拍摄肿瘤

20、的照片，还是那句话，最好都有，至少资料中放一个，另外一份备好，答辩的时候可以随时展示。另外，以前不允许数码拍摄，要求光学照相机，以防电脑编辑，不知道现在还有没有类似的要求。 5.有的人要看肿瘤生长曲线，有的人要看T/C的曲线，不过一般放生长曲线的多一些，记住，生长曲线现在要求RTV，相对肿瘤体积。以前报批的时候就可以放RTV曲线了，现在更是RTV的天下。 6.一般来说，正式试验基本上就是这么设计了，但是你最好有这些剂量、疗程、给药途径等的设计依据，比如权威文献、你们的预试验等材料备问。当然，如果你的药物有些特别的地方，那么要根据他的具体特点设计试验。 7.

21、0;这个是锦上添花的指标，对于药效试验来说，没有明确要求，但是一定要有体重和死亡的数据。 8. 老原则要求重复两次，一共三次试验，新原则前几稿要求重复一次，一共三次试验，但是最新一稿我没有看到对于重复试验的要求，但是作为药理研究的基本常识，重复试验是一定需要的，作为正式试验的重复试验应该把数据和结果分析都列入报告中，重复试验之间是同等重要的。 zym: 针对您的回答,我仍有几点不解 1.实验结束后瘤的质量标准问题,您说新原则没有指标,那么老原则(就是现在还遵循的原则)具体是多少呢,能不能说明一下啊? 2. T/C标准按照体积

22、计算的时候,按照的是哪个时间点的体积呢,还是说整个测量过程的体积都要算? 3.还有一个比较基本的问题,不要笑话我了，呵呵,那个RTV是怎样算出来的?是用药组数据减去空白组数据吗?还是其他算法? 4.正式实验中,每组的动物数量是多少?6只,还是10-12只? 5.对给药时间有没有什么具体要求呢,就是说有没有上限,比如不可以超过一个月啊什么的? swordzjsh 1. 老原则的标准就是你写出来的那个。 2. 整个测量过程的体积都要算，可以用T/C对时间点作图的那种。实际上，不知道你有没有老的指导原则，上面有一个表，那

23、个表里面汇总了一些试验的基本信息，那个表里面要填增殖率，一般是选效果最好的那一天的数据填上去。 3. RTV = Vt / V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。RTV是针对每一只小鼠计算的。 4. 对于裸鼠来说，5到10 只，要根据你的药物的性质来定，如果SD较大，建议多设几只，容易做出统计差异。如果SD较小，不少于6只，因为要求试验过程中动物死亡率不超过20%，6只动物死了一只还可以接受，要是5只动物死了一只就是20%了。 5. 没有具

24、体的要求，一般在3到5周，常见为三周，并且保证肿瘤长到足够的大小。如果有特别的原因可以变化试验周期，但是一般都是加长而不会缩短。 实验分组与标记 baobaogao: 我的实验是观察药物对lewis肺癌的生长的影响。 1、实验分为五组（模型组、阳性对照组（CTX）药物大、中、小剂量组）。我不清楚需不需要设置阴性对照组（就是不造模组，）2、C57小鼠怎样标记，有剪趾、穿耳孔的方法。但是具体的操作没有说明，能否介绍一下。 swordzjsh 1.不需要设normal组，因为肿瘤的生长和评价非常明显，不会有干扰的可能。 2.

25、60;我一般是剪耳号，一只小鼠两只耳朵，每只耳朵可以剪上侧和下侧两个位点，你可以自己指定组合，比如我们是这样的：左上为一号，左下为二号，右上为三号，右下为四号，左侧上下为五号，右侧上下为六号，左上右上为七号，左下右下为八号. 细胞悬浮液体 roger150 ,在做肿瘤模型用细胞接种时,细胞悬浮在什么液体里面.有没用matrigel同细胞混匀后再接种的? Swordzjsh:一般来说，可以悬浮在相应的无血清培养基、PBS、saline中，接种效果以上三种次第降低。用matrigel是一种促进肿瘤形成生长的手段，如果本身肿瘤生长不是特别困难不建议用它，但是一

26、些比如A549之类的细胞株，接种后五六十天还只有600700mm3的肿瘤，就可以考虑使用matrigel。使用matrigel的时候要注意低温操作，因为室温下mareigel就有可能固化。一般是在冰浴中操作。 白血病肿瘤,皮下注射or静脉注射？ abaiabai 我的理解是，静脉注射反应的是疾病全身播散的作用，皮下注射便于观察瘤块大小，衡量用药效果，应该结合自己试验的目的选择注射方法 我最近刚刚实验比较了一下静脉注射和皮下接种白血病细胞株，从理论上说静脉接种似乎皮下接种更接近白血病的生物行为特点，但是根据我的实验和以前的文献，静脉接种小鼠的平均生存期很短

27、，我的不超过10天，我还试验性的进行了化疗，结果几乎全死了，而皮下接种者结果稳定。所以选皮下还是静脉，应该根据自己的试验目的来定，长期的实验好像不太适合用静脉注射的方法。 swordzjsh 皮下或者静脉注射都可以，看你的细胞株了，也有用腹腔注射的。  小鼠的捉拿 从笼盒内将小鼠尾部捉住并提起，放在笼盖（或表面粗糙的物体）上，轻轻向后拉鼠尾，在小鼠向前挣脱时，用左手拇指和食指抓住两耳和颈部皮肤，无名指、小指和手掌心夹住背部皮肤和尾部，并调整好动物在手中的姿势。这类捉拿方法多用于灌胃以及肌肉、腹腔和皮下注射等。如若进行心脏采血、解剖、外科手术等实

28、验时，就必须要固定小鼠。使小鼠呈仰卧位（必要时先进行麻醉），用橡皮筋将小鼠固定在小鼠实验板上。如若不麻醉，则将小鼠放人保定架里，固定好保定架的封口。 小鼠性情较温顺，一般不会咬人，比较容易抓取固定。通常用右手提起小鼠尾巴将其放在鼠笼盖或其它粗糙表面上，在小鼠向前挣扎爬行时，用左手拇指和食指捏住其双耳及颈部皮肤，将小鼠置于左手掌心、无名指和小指夹其背部皮肤和尾部，即可将小鼠完全固定。在一些特殊的实验中，如进行尾静脉注射时，可使用特殊的固定装置进行固定,如尾静脉注射架或粗的玻璃试管。如要进行手术或心脏采血应先行麻醉再操作,如进行解剖实验则必须先行无痛处死后再进行。 实验动物的编

29、号 编号的方法很多，根据动物的种类数量和观察时间长短等因素来选择合适的标记方法。 (一) 挂牌法：将号码烙压在圆形或方形金属牌上(最好用铝或不锈钢的,它可长期使用不生锈),或将号码按实验分组编号烙在栓动物颈部的皮带上，将此颈圈固定在动物颈部。该法适用于狗等大型动物。(二)  (二)打号法：用刺数钳(又称耳号钳)将号码打在动物耳朵上。打号前用蘸有酒精的棉球擦净耳朵，用耳号钳刺上号码，然后在烙印部位用棉球蘸上溶在食醋里的黑墨水擦抹。该法适用于耳朵比较大的兔、狗等动物。 (三)针刺法：用七号或八号针头蘸取少量碳素墨水，在耳部、前后肢以及尾部等处刺入皮下，在受刺

30、部位留有一黑色标记。该法适用于大小鼠、豚鼠等。在实验动物数量少的情况下，也可用于兔、狗等动物。 (四)化学药品涂染动物被毛法：经常应用的涂染化学药品有 涂染红色：0.5中性红或品红溶液。涂染黄色：3-5苦味酸溶液。 涂染黑色：煤焦油的酒精溶液。 根据实验分组编号的需要，可用一种化学药品涂染实验动物动物背部被毛就可以。如果实验动物数量较多，则可以选择两种染料。该方法对于实验周期短的实验动物较合适，时间长了染料易退掉；对于哺乳期的子畜也不适合，因母畜容易咬死子畜或把染料舔掉。 (五)剪毛法：该法适用于大、中型动物，如狗、兔等。方法是用剪毛刀在动物一

31、侧或背部剪出号码，此法编号清楚可靠，但只适于短期观察。 (六)打孔或剪缺口法：可用打孔机在兔耳一定位置打一小孔来表示一定的号码。如用剪子剪缺口,应在剪后用滑石粉捻一下,以免愈合后看不出来。该法可以编至1 9999号，此种方法常在饲养大量动物时作为终身号采用。 实验动物的分组  (一)分组的原则：进行动物实验时，经常需要将选择好的实验动物按研究的需要分成若干组。动物分组应按随机分配的原则，使每只动物都有同等机会被分配到各个实验组与对照组中去，以避免各组之间的差别,影响实验结果，特别是进行准确的统计检验,必须在随机分组的基础上进行。 每组

32、动物数量应按实验周期长短、实验类型及统计学要求而定。如果是慢性实验或需要定期处死动物进行检验的实验，就要求选较多的动物，以补足动物自然死亡和认为处死所丧失的数量，确保实验结束时有合乎统计学要求的动物数量存在。 (二)建立对照组：分组时应建立对照组。1.自身对照组：是指实验数据而言。实验动物本身在实验处理前、后两个阶段的各项相关数据就分别是对照组和实验组的实验结果，此法可排除生物间的个体差异。2.平行对照组：有正对照组和负对照组两种。给实验组动物某种处理，小鼠采血方法 1.割(剪)尾采血 当所需血量很少时采用本法。固定动物并露出鼠尾。将尾部毛剪去后消毒，然后浸在45

33、左右的温水中数分钟，使尾部血管充盈。再将尾擦干，用锐器(刀或剪刀)割去尾尖0.3-0.5cm，让血液自由滴入盛器或用血红蛋白吸管吸取，采血结束，伤口消毒并压迫止血。也可在尾部作一横切口，割破尾动脉或静脉，收集血液的方法同上。每鼠一般可采血10余次以上。小鼠每次可取血0.1ml，大鼠0.30.5ml。  2.鼠尾刺血法 大鼠用血量不多时(仅做白细胞计数或血红蛋白检查)，可采用本法。先将鼠尾用温水擦拭，再用酒精消毒和擦拭，使鼠尾充血。用7号或8号注射针头，刺入鼠尾静脉，拔出针头时即有血滴出，一次可采集1050mm3。如果长期反复取血，应先靠近鼠尾末端穿刺，以后再逐渐向

34、近心端穿刺。  3.眼眶静脉丛采血 采血者的左手拇食两指从背部较紧地握住小鼠或大鼠的颈部(大鼠采血需带上纱手套)，应防止动物窒息。当取血时左手拇指及食指轻轻压迫动物的颈部两侧，使眶后静脉丛充血。右手持续接7号针头的1ml注射器或长颈(34cm)硬质玻璃滴管(毛细管内径0.5-1.0mm)，使采血器与鼠面成45的夹角，由眼内角刺入，针头斜面先向眼球，刺入后再转180度使斜面对着眼眶后界。刺入浓度，小鼠约23mm，大鼠约45mm。当感到有阻力时即停止推进，同时，将针退出约0.1-0.5mm，边退边抽。若穿刺适当血液能自然流入毛细管中，当得到所需的血量后，即除去加于颈部

35、的压力，同时，将采血器拔出，以防止术后穿刺孔出血。 若技术熟练，用本法短期内可重复采血均无多大困难。左右两眼轮换更好。体重20-25g的小鼠每次可采血 0.2-0.3ml；体重200-300g大鼠每次可采血0.5-1.0ml，可适用于某些生物化学项目的检验。4.断头取血 采血者的左手拇指和食指以背部较紧地握住大(小)鼠的颈部皮肤，并作动物头朝下倾的姿势。右手用剪刀猛剪鼠颈，约1/2-4/5的颈部前剪断，让血自由滴入盛器。小鼠可采用约0.81.2ml;大鼠约5-10ml。  5.心脏采血 鼠类的心脏较小，且心率较快，心脏采血比较困难，故

36、少用。活体采血方法与豚鼠相同。若做开胸一次死亡采血，先将动物作深麻醉，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，吸取血液。小鼠约0.5-0.6ml；大鼠约0.8-1.2ml。  6.颈动静脉采血 先将动物仰位固定，切开颈部皮肤，分离皮下结缔组织，使颈静脉充分暴露，可用注射器吸出血液。在气管两侧分离出颈动脉，离心端结扎，向心端剪口将血滴入试管内。  7.腹主动脉采血 最好先将动物麻醉，仰卧固定在手术架上，从腹正中线皮肤切开腹腔，使腹主动脉清楚暴露。用注射器吸出血液，防止溶血。或用无齿镊子剥离结缔组织，夹住动脉近心端，用尖头手术剪刀，剪断动脉

37、，使血液喷入盛器。  8.股动(静)脉采血 先由助手握住动物，采血者左手拉直动物下肢，使静脉充盈。或者以搏动为指标，右手用注射器刺入血管。体重15-20g 小鼠采血约0.2-0.8ml，大鼠约0.4-0.6ml。 实验动物用药量的确定及计算方法 (一)动物给药量的确定 1. 先用少量小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量,然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一作为应用剂量，一般可取1/101/5。 2. 植物药粗制剂的剂量多按生药折算。 3. 化学药品可参考化学结构相似的已

38、知药物， 特别是化学结构和作用都相似的剂量。 4. 确定剂量后，如第一次用药的作用不明显，动物也没有中毒的表现,可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。在一般情况下，在适宜的剂量范围内，药物的作用常随剂量的加大而增强。所以有条件时，最好同时用几个剂量作实验，以便迅速获得关于药物作用的较完整的资料。如实验结果出现剂量与作用强度之间毫无规律时，则更应慎重分析。 5. 用大动物进行实验时，防止动物中毒死亡,开始的剂量可采用鼠类的1/151/2,以后可根据动物的反应调整剂量。 6. 确定动物给药剂量时

39、，要考虑给药动物的年龄大小和体质强弱。 一般说确定的给药剂量是指成年动物的，如是幼龄动物，剂量应减小。如以狗为例：6 个月以上的狗给药剂量为1份时，36个月的给1/2份， 4589日的给1/4份，2044日的给1/8 份，1019日的给1/16份。 7. 确定动物给药剂量时，要考虑因给药途径不同，所用剂量也不同。 以口服量为100时，皮下注射量为3050，肌肉注射量为2030，静脉注射量为25。 (二)人与动物的用药量换算方法 人与动物对同一药物耐受性不同，一般动物的耐受性要比人大，单位体重的用药量动物比

40、人要高。必须将人的用药量换算成动物的用药量。一般可按下列比例换算： 人用药量： 1 小鼠、大鼠： 50100兔、豚鼠： 1520 狗、猫： 510 以上系按单位体重口服用药量换算。如给药途径为静脉、皮下、腹腔注射，换算比例应适当减小些。 实验动物给药途径和方法 （一）皮下注射 注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有5（1/2）号针头的注射器刺入皮下。皮下注射部位一般狗、猫多在大腿外侧，豚鼠在后大腿的内侧或小腹部；大白鼠可在侧下腹部。兔在背部或耳根部注射。蛙可在脊背部淋巴腔注射。

41、0;（二）皮内注射 皮内注射时需将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮肤并使之绷紧，在两指之间，用结核菌素注射器连4(1/2)细针头，紧贴皮肤表层刺入皮内，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射药液，此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。  （三）肌肉注射   肌肉注射应选肌肉发达，无大血管通过的部位，一般多选臀部。注射时垂直迅速刺入肌肉，回抽针栓如无回血，即可进行注射。给小白鼠、大白鼠等小动物作肌肉注射时，用左手抓住鼠两耳和头部皮肤，右手取连有5（1/2）针头的注射器，将针头刺入大腿外侧肌肉，将药液注入。 （四）腹腔

42、注射  用大、小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推 0.51.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液，为避免伤及内脏，可使动物处于头低位，使内脏移向上腹。若实验动物为家兔，进针部位为下腹部的腹白线离开1cm处。  （五）静脉注射 小白鼠和大白鼠：一般采用尾静脉注射，鼠尾静脉有三根，左右两侧及背侧各一根，左右两侧尾静脉比较容易固定，多采用，背侧一根也可采用，但位置容易固定。操作时先将动物固定在鼠筒内或扣在烧杯中，使尾巴露出，尾部用4550的温水浸润半分钟或用酒精

43、擦拭使血管扩张，并可使表皮角质软化，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，使静脉充盈，用中指从下面托起尾巴，以无名指和小指夹住尾巴的末梢，右手持注射器连4(1/2)号细针头，使针头与静脉平行（小于30），从尾下四分之一处（约距尾尖2-3厘米）处进针，此处皮薄易于刺入，先缓注少量药液，如无阻力，表示针头已进入静脉，可继续注入。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血。如需反复注射，应尽可能从末端开始，以后向尾根部方向移动注射。  几种常用的动物不同给药途径的注射量  （六）淋巴囊注射  蛙类常采用此法，因其皮下有数个淋巴囊，注入药物甚易吸收。腹部淋巴

44、囊和头背淋巴囊常作为蛙类给药途径。一般多选用腹部淋巴囊给药。注射时将针头从蛙大腿上端刺入，经大腿肌层入腹壁肌层，再进入腹壁皮下，即进入淋巴囊，然后注入药液。有时也可采用胸淋巴囊给药。方法是将针头刺入口腔，使穿过下颌肌层入胸淋巴囊内注入药液，一次最大注射量为1毫升。蛙全身分布为咽、胸、背、腹侧、腹、大腿和脚等七个淋巴囊。 （七）经口给药 在急性试验中，经口给药多用灌胃法，此法剂量准确，适用于小白鼠、大白鼠、家兔等动物。 小鼠、大鼠（或豚鼠）用输血针头或小号腰穿针头，将其尖端斜面磨剂，用焊锡在针尖周围焊一圆头，注意勿堵塞针孔，即成灌胃针；亦可用烧成圆头的硬质玻璃毛细管

45、或特制的塑料毛细秋，作为导管。灌胃时将针按在注射器上，吸入药液。左手抓住鼠背部及颈部皮肤将动物固定，右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿咽后壁徐徐插入食道。动物应固定成垂直体位，针插入时应无阻力。若感到阻力或动物挣扎时，应立即停止进针或将针拔出，以兔损伤或穿破食道以及误入气管。一般当灌胃针插入小鼠34cm，大鼠或豚鼠4-6cm后可将药物注入。常用的灌胃量小鼠为0.2-1ml，大鼠1-4ml，豚鼠为1-5ml。各种动物一次灌胃能耐受的最大容积小鼠为0.5-1.0ml，大鼠4-7ml，豚鼠为4-7ml，家兔为80-150ml，狗为200-500ml。 八）其它途径给药 

46、60;1呼吸道给药 呈粉尘、气体及蒸气或雾等症状存在药物或毒气，均需要通过动物呼吸道给药。如一般实验时给动物乙醚作吸入麻醉，给动物吸一定量的氨气、二氧化碳等观察呼吸、循环等变化；给动物定期吸入一定量的SO2。锯末烟雾等可造成慢性气管炎动物模型等；特别在毒物学实验中应用更为广泛。  2皮肤给药 为了鉴定药物或毒物经皮肤的吸收作用、局部作用、致敏作用和光感作用等，均需采用经皮肤给药方法。如家兔和豚鼠常采用背部一定面积的皮肤脱毛后，将一定药液涂在皮肤上，药液经皮肤吸收。 3脊髓腔内给药 此法主要用于椎管麻醉或抽取脑脊液。的灌胃针头的头端用锡

47、或者适宜的方法处理了针头的锐口，自己用砂纸不可能将所有的锐口都磨掉，用这样的针头灌胃，损失小鼠食道的可能性比较大。 2.抓住小鼠，使其头、颈和身体呈一直线。抓小鼠的动作很简单，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部即可。因为小鼠始终在活动中，若一次抓的感觉不是很顺手，要放开重新抓，不要逞强进行下一步操作。 3. 抓好小鼠就可以灌胃了，一般用1ml的注射器配灌胃针头。灌胃针头从小鼠的嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进，进入食管后会有一个刺空感，进入食道后就可以推注药液了。（我认为，所谓的灌胃，不必要灌胃针头进入小鼠的胃部，进入食管后就可

48、以推药了，这样对小鼠食道的损伤要小点，特别是要长期灌胃给药的情况下。）当然，灌胃针头也可以再往里面深入一点，防止药液从口中流出。 4. 灌胃容积一般是0.10.2ml/10g，最大0.35ml/10g，每只小鼠的灌胃最大容积不超过0.8ml。 小鼠腹腔注射 1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。 2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官

49、。 3. 尤其是对于体重较小的小鼠，腹腔注射时针头可以在腹部皮下穿行一小段距离，最好是从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。 4. 小鼠腹腔注射的给药容积一般为510ml/kg。 小鼠静脉注射 操作步骤： 1. 首先要固定小鼠，最简单的固定方法就是把小鼠放在盒子里面，让它的尾巴伸在盒盖的外面，用手抓住小鼠尾巴，轻轻往外拽，就可以固定好小鼠了。这种固定方法，小鼠可以在盒子里面活动，固定的也不是很牢固，但是只要你尾静脉注射的手法很熟练，就足以用来注射了

50、。 还有的固定方法就是用一个小的圆筒，最好是金属做的，（可以在当地的铁匠铺，或者买白铁铺里面定做）首先是金属比较结实，而且可以用来固定在铁架台上，方便操作。圆筒的一段有个盖子可以拿下来，盖子中间有个小孔，可以让小鼠的尾巴伸出来（中间的小孔可以用胶布缠一下，防止锐利的边缘割伤小鼠尾巴）。另外一段可以用金属网的结构，网的形状可以做成子弹头的头端形状。网状结构可以让光线透近来，方便小鼠钻进圆筒里面。圆筒的长度约10cm，直径约 34cm，可以做个系列长度和直径的圆筒，适合不同大小的小鼠。 2. 固定好小鼠后就是注射了，一般用一次性的1ml的注射器就可以了，玻璃

51、 的1ml的注射器也可以用，针头用4号的就可以了。 3. 注射前首先要让小鼠的血管充盈。可以采用75%的酒精棉球擦拭的方法或者采用温水浸泡的方法。若小鼠的血管很不清楚，推荐采用温水浸泡的方法，水温以不烫手为宜。温水浸泡23分钟后，取出小鼠尾巴，用干棉球擦拭。等一会儿，待血管充盈后，酒精棉球擦拭后就可以进针了。若血管还不充盈，可以反复用温水浸泡，切不可冒险注射，除非你手法很熟练，另当别论。 4. 小鼠尾部共有四条血管，一般认为左右的两条静脉比较容易注射，多采用这两条静脉进针。一般要求进针部位靠近小鼠的尾端，这样若注射失败的话，还可以再向上选择进针

52、点。但是进针部位也不可以太靠下，因为越往下，静脉越细，操作越难，一般以小鼠尾巴下三分之一的位置比较好。 5. 最关键的就是进针了。进针时操作者左手食指和拇指固定住小鼠的尾巴，让小鼠的尾巴在经过拇指后向下弯曲，进针点靠近拇指指甲。针头和血管呈约30°角，针尖斜面朝上，轻轻挑刺入皮肤后针头立即和血管平行，一般情况下一次就可以进入血管，可以将针头刺入血管一大半，左右轻轻晃动针头，确定针头在血管内，就可以推注药液了，正常情况下，推注的过程应该没有明显阻力，血管也不会鼓起。推液时动作宜轻柔，若发现血管鼓起，那是针头没有刺入血管，需立即拔出针头。 皮下注射给药

53、60;将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时，常规消毒注管。此法可采血0.81.2ml。 swordzjsh肿瘤造模实验中的一点心得： 动物选择：KM小鼠，裸鼠，C57 等均可作为，但是个人认为KM能做出来最好，毕竟比较有普遍性，还是正常生理状态的健康动物，比较有说服力，还便宜，裸鼠或者其他特定品种，比较适合特定的瘤株 瘤株类型： H22 S180; EAC 等 关于肿瘤细胞活力的问题：一般买回来的瘤株，需要经过复苏过程，很多人复苏以后

54、就直接给动物接种了，或者传一代以后就开始实验了，一般这个时候肿瘤细胞活力往往是不够的，很难在短时间内长到规定重量，所以建议至少在动物体内传2代，让肿瘤细胞活力充分体现以后再开始用于实验。 关于接种部位的问题：以小鼠为例一般可以选择腋下或者后肢，有的文章说是背部接种，但是背部血管不发达，营养不够，一般不建议采用。接种一般采用皮下注射，针头我喜欢沿皮肤水平进入，然后挑起表皮，注射，接种后3天我开始给药。 给药时间：一般从开始造模起2周内我就会处理动物了，因为肿瘤如果扩散后会导致动物的大量死亡，毕竟是肿瘤啊，动物大量死亡的时间也相对集中，也许前一天还好，过一晚上就死掉不少，那个时

55、候你哭都找不到坟头，只要肿瘤差不多够重了就处理吧。 关于进食水的问题：别个都要死掉了，就别吝啬了，想吃就吃，想喝就喝吧。 关于模型对照组的问题： 我已经在别的帖子里面强调过了，这次再强调一下，接种以后一定要每天去骚扰它们一下，我有次试验偷懒，模型组没有管他们，结果模型组的肿瘤最后比给药组还小，都只有绿豆大，导致试验失败，郁闷死，后来重做的时候每天坚持给模型组生理盐水，结果肿瘤疯长。说起来很奇怪，但是这个是事实，以后我再没有偷懒过，每次都成功复制出了模型。 关于肿瘤重量的问题：模型组肿瘤重量应该不低于0。5g，我不记得在哪本书上看到的了，反正是有个规定的&

56、#160;剥瘤 zhangweilcb：腋窝的肿瘤长到第12天时，肿瘤在2.0g左右，我在剥瘤子时感觉比较困难，对于一个瘤子，在剥的前半段还是比较好剥的，但越往里越难剥，主要是瘤子在腋窝深处和小鼠的右肢长到一块，不容易区分，每次剥完后，在最里面总感觉还剩一点肿瘤在那里。而且，经常把血管剪破，导致血液流出。不知该如何处理。肿瘤细胞可否接种到小鼠腋窝偏下，或是接近腹部？我想这样在剥瘤子时会轻松些，请指教。 swordzjsh：接种的时候要精确控制接种在皮下，靠皮内会与皮肤强烈粘连，靠肌肉会与肌肉强烈粘连，而且不要太靠腋窝里面，可以往尾部靠一些，多接几次体会一下吧。另外也可以稍微