含萘环结构的手性Salen-Mn(III)配合物与DNA的相互作用-

1、含萘环结构的手性Salen-Mn(III配合物与DNA的相互作用11彭斌1,巢晖2,计亮年21湖南科技大学化学化工学院,湖南湘潭(4112012中山大学化学化工学院,广东广州(510275E-mail: bpeng摘要:合成了含萘环结构的手性Salen-Mn(III配合物,Mn(IIIL+Cl (L = N,N- bis- (2- hydroxynaphthalene-1-carbaldehyde-(1R,2R-(-diaminocyclohexane (R 和N,N-bis- (2 - hydroxynaphthalene-1-carbaldehyde-(1S,2S-(+- diamino-

2、 cyclohexane (S ,运用紫外光谱滴定和粘度实验,研究了配合物与DNA 的插入作用。并通过凝胶电泳观察了配合物对pBR322 DNA的断裂情况,结果表明配合物以插入模式与DNA结合,呈现出手性差异;在H2O2存在下,配合物能够使pBR322 DNA断裂。关键词:锰配合物;Salen配体;DNA 作用中图分类号:O611.31.引言近几十来,过渡金属配合物与DNA的相互作用受到很大的关注1-4,这些配合物涉及了多种形式,如:金属-卟啉、金属-多吡啶、金属-大环和金属-Salen配合物等5-7。这些配合物可以通过多种模式(插入、静电、沟面结合等与DNA结合,其中插入模式能够较明显的引起

3、体系的一系列物化性质的改变,对于发展DNA探针、足迹试剂以及化学核酸酶都是很有意义的8,9。近些年来,过渡金属配合物与DNA的非共价结合的研究,在多吡啶和卟啉方面做了大量的工作,发现很多配合物具有插入DNA并使其断裂的能力。相对而言,在Salen-金属配合物方面的工作相对较少,研究发现,Salen与一些过渡金属形成的配合物在氧化/还原剂的存在下,也能够断裂DNA10。Dennis J. Gravert 和 John H. Griffin 11-12合成了一些含有手性的金属锰(III的配合物,发现它们在与DNA作用时,不但有空间选择性,而且还具有手性选择性。不过,这些配合物的配体基本是以苯环为刚

4、性平面,插入DNA碱基面中的能力不强,主要以沟面结合为主。我们设想如果以萘环代替苯环,扩大相应的芳香刚性平面,有可能使Salen-金属配合物与DNA的作用具有新的性质。在本文中,合成了含萘环结构的手性Salen-Mn(III配合物,Mn(IIIL+Cl (L = N,N- bis-(2-hydroxynaphthalene-1-carbaldehyde-(1R,2R-(-diaminocyclohexane (R 和N,N-bis-(2-hydroxynaphthalene-1-carbaldehyde-(1S,2S-(+- diamino- cyclohexane (S ,并通过光谱、粘度测

5、定等方法研究配合物与DNA的作用,通过凝胶电泳观察了配合物对pBR322 DNA的断裂情况,结果表明配合物以插入模式与DNA结合,呈现出手性差异;在H2O2存在下,配合物能够使pBR322 DNA断裂。2. 实验部分2.1 实验材料小牛胸腺DNA(CT-DNA,BR,华美生物工程公司;pBR 322 DNA,BR,上海生工1本课题得到国家自然科学基金(20771105和湖南科技大学科研启动基金资助。生物工程公司;溴化乙锭(EB,AR级,Fluka公司产品;琼脂糖,高强度DNA级,进口分装。(1R, 2R-(-1,2-diaminocyclohexane 和 (1S,2S-(+-1,2-diam

6、inocyclohexane。其它试剂和溶剂均为分析纯产品。配体和配合物的合成路线见图1。CHO+2H2 2CH3CH2OH50o C2hr reflux2+图1 配体和配合物合成路线图2.2 配体和配合物的合成Salen配体的合成参照文献12进行。在圆底烧瓶中放入0.85克(5 mmol2-hydroxy-1-naphthaldehyde,加入无水乙醇(10 ml,温热,使萘醛完全溶解。在搅拌下,滴加(1R, 2R-(-1,2-diaminocyclohexane 或(1S,2S- (+ -1,2-diaminocyclohexane 的乙醇溶液(0.064克,1.06 mmol样品溶于10

7、 ml无水乙醇中,溶液逐渐变成橙黄色,并有黄色沉淀生产,继续搅拌1小时,冷却到室温后,过滤,真空干燥,用氯仿-乙醇重结晶,得到黄色针状晶体:N,N-bis-(2-hydroxynaphthalene-1- carbaldehyde -(1R,2R-(-diaminocyclohexane (Salen R和N,N-bis-(2- hydroxynaphthalene -1- carbaldehyde - (1S,2S-(+- diaminocyclohexane (Salen S。产率:75%。元素分析:Found: C, 79.68; H, 6.31; N, 6.62。Calc. For C

8、28H26N2O2: C, 79.59; H, 6.20; N, 6.63%. ES-MS: m/z = 423 (M+1。 IR (KBr, /cm-1: 3011(m,2944(s,2863(m,1628(s,1602(sh,1547(m,1526(w, 1493(w,1479(w,1451(w,1403(m,1367(sh,1350(m,1314(m,1246 (m,1187(m,1143(m,1094(m,1035(w,860(m,828(m。1H NMR (ppm, CDCl3: 14.66( s , 2H , OH, 6.85(dd, 2H , ArH , 7.52(dd, 2H

9、, ArH, 7.45(dd, 2H , ArH,7.13(dd, 2H , ArH, 7.30(dd, 2H , ArH, 7.72(dd, 2H, ArH, 8.75(s, 2H , CH=N, 3.41(s,Chiral-2H, 2.10-1.49(m , 8H , CH2。配合物的合成参照文献13,14进行。在氩气保护下,将配体(0.12 g, 0.27 mmol溶于5 ml丙酮中,然后滴加氢氧化钠的乙醇溶液(0.02 g, 0.54 mmol,15分钟后,加入Mn(OAc2·4H2O (0.134 g, 0.54 mmol,回流,搅拌1.5小时后,停止氩气,加入LiCl (

10、0.104 g, 0.54 mmol,然后向溶液中鼓入空气,继续反应30分钟。冷却,旋蒸掉部分溶剂,加入25 ml 冷水,过滤沉淀,用冷水、丙酮和乙醇洗涤,真空干燥。用乙醇重结晶,得到Mn(IIIL+Cl棕色粉末,产率:50%。元素分析:Found: C, 65.71; H, 4.65; N, 5.52。Calc. For C28H24N2O2MnCl: C, 65.83; H, 4.73; N, 5.48. ES-MS: m/z = 475 (M-Cl. IR (KBr, /cm-1: 3436(m, 2933(w, 1617(s, 1603(s, 1540(m, 1508(w, 1452(

11、w,1431(w, 1393(m, 1339(s, 1307(m, 1214(w, 1189(m, 1144(w,1095(w, 981(m, 830(m,759(m, 569(s。2.3 DNA 结合实验2.3.1 紫外光谱滴定参比池和样品池中分别加入3 mL的缓冲液和20 µM 的配合物溶液,分次向参比池和样品池中分别加入相同体积的DNA母液,使DNA 与配合物浓度比值DNA/Ru按一定的比例递增,直至扣除稀释效应后吸收峰不再减色。每次混和均匀约5分钟后,在200800 nm范围记录样品的紫外可见光谱。2.3.2 粘度实验DNA样品的粘度使用乌氏粘度计测量。测量粘度时,温度恒定在

12、28.0 (± 0.1°C。相对粘度按 = ( t t0/t0计算,t0为缓冲液流经毛细管所需的时间,t为DNA样品(含浓度不等的配合物流经毛细管所需的时间。以(/01/3对r(r = Ru/DNA作图。0为不含配合物的DNA样品的相对粘度。2.3.3 琼脂糖凝胶电泳实验电泳反应液是由Tris缓冲溶液配制。向含有pBR 322 DNA的溶液中加入一定浓度的配合物溶液,1 mM H2O2过氧化氢,混匀,使反应液的终体积保持在10 µL。37下恒温培育5 h 后,加入溴酚兰溶液使反应终止。最后将此电泳反应液在5 × TBE电泳缓冲液中,1 %的琼脂糖凝胶平板

13、上,于70 V,50 mA的恒压恒流下电泳,然后以0.5 µg/ml溴化乙锭为显色剂,用Kodak DC 40/120凝胶自动成像分析系统分析产物。3. 结果和讨论3.1 电子吸收光谱滴定吸收光谱是研究配合物与DNA作用最常用的方法之一。通常,配合物与DNA结合后,其电子结构会受到DNA的微扰,导致配合物的紫外可见光谱发生一系列的变化,对于不同类型的配合物或同类型的配合物不同结合方式,吸收光谱的变化程度不同。一般来讲,当小分子配合物以插入模式与DNA作用时,其吸收光谱会出现一定的减色效应和峰位红移现象。这是因为插入配体与DNA的碱基对发生电子堆积后,使其*空轨道与碱基的电子轨道发生偶

14、合,能级下降,从而导致*跃迁能减小,产生红移现象。同时,偶合后的轨道因部分填充电子,使跃迁几率减小,产生减色效应。 A b s o r b a n c eWavelenth/nmA b s o r b a n c eWavelenth/nm图2 配合物与DNA 作用的紫外光谱滴定图图2是配合物Salen R (a 和配合物Salen S (b在滴加DNA 前后的电子吸收光谱图,随着DNA 浓度的增加,配合物R 、配合物S 的吸收光谱均出现了明显的减色效应, 当DNA/Mn 比率为13时,配合物R 的332 nm 峰减色约39.3%。对于配合物S ,在相同条件下,其332 nm 峰约减色32.6

15、%。该光谱变化特征表明配合物可能以插入方式与DNA 作用,与其它一些Salen 配合物(以苯环为基本结构的变化是不同的15,16。另外,从图中看出,配合物S 与DNA 作用似乎弱于配合物R 。为了定量比较配合物与DNA 的结合强弱,通过电子吸收光谱滴定实验,以配合物在332 nm 的吸光度的变化,按下列方程式17分别算出配合物与DNA 作用的结合常数K (见图2中的小插图。DNA/(a - b = DNA/(a - f + 1/Kb (b - f 式中DNA代表DNA 的浓度,a ,f 和b 分别代表在各DNA 浓度下的、游离的和与DNA 结合饱和时配合物的摩尔吸光系数。Kb 可由拟合直线与y

16、 轴相交的截距求得。计算结果为:配合物R 的为(1.26 ± 0.12 × 104 M -1,而配合物S 的为 (1.09± 0.13 × 104 M -1。配合物R 与DNA 的结合常数略大于配合物S 。此结果表明,Salen 的手性桥接基团对配合物与DNA 的结合有影响。3.2 配合物与DNA 相互作用的粘度研究为了进一步分析配合物与DNA 的作用形式,我们做了粘度测量。在缺少晶体结构数据的条件下,粘度测试是检测配合物与DNA 以何种模式结合的最有效的方法,其结果比光谱数据更具说服力36。将配合物R 、S 分别加入到DNA 溶液后,引起的DNA 粘度

17、的变化情况表示于图4.5中。 (/01/3Mn/DNA图4 配合物对DNA 粘度的影响从图中可见,随着两个配合物的浓度增加,DNA 的粘度也是逐步升高,再次说明配合物以插入模式与DNA 结合。从DNA 粘度的增加幅度看,配合物R >配合物S ,这也反映了它们与DNA 的结合强度,与前面的电子吸收光谱滴定实验得到的结果一致。3.3 凝胶电泳法研究配合物对质粒DNA 的断裂反应凝胶电泳是研究核酸和蛋白质等生物大分子的一项重要技术,因为其操作简单、快速和灵敏等优点,而成为分离鉴定和提纯核酸的首选方法,在断裂DNA 实验中主要用到此方法。对不同构型的DNA ,在电泳中的迁移率是不同的,质粒DNA

18、 中存在的三种构型。其中共价闭环的超螺旋Form I 的结构最为紧密,迁移率最大,走在最前面。线形的Form III 走在其次。而开环缺刻的Form II 由于结构比较松散,走在最后面。作者观察了Salen -Mn 配合物在37下温育5个小时及过氧化氢存在下对DNA 的断裂情况,发现这两个配合物都可以将pBR 322 DNA 有form I 转化为form II ;而只有过氧化氢存在时,没有观察到DNA 的明显断裂。说明Salen -Mn 在氧化剂存在下,表现出化学核酸酶活性。同时,我们注意到,这两个配合物在断裂pBR 322 DNA 时,并没有表现出明显的手性差异(图5。图5 配合物和H 2

19、O 2存在下,pBR322 DNA 的凝胶电泳图Lane 0, DNA alone; Lane 1, DNA + H 2O 2 (1 mmol/L; lane 2, 3, 6, DNA + H 2O 2 + complex R : 20, 40, 80mol/L; lane 4, 5, 7, DNA + H 2O 2 + complex S : 20, 40, 80 mol/L.4. 结论合成了含萘环结构手性桥接基团的Mn -Salen 配合物,运用吸收光谱、粘度法和凝胶电泳实验研究了配合物与DNA 的相互作用。实验结果指出这些配合物能够与DNA 通过插 入模式结合，这两个配合物与 CT DN

20、A 的结合存在显著的手性差异，说明 Salen 的桥接基团 对配合物与 DNA 的结合是有影响的。此外，这两个配合物在氧化剂 H2O2 存在下，能够使 将 pBR 322 DNA 由 form I 转化为 form II。 参考文献 1. J.K. Barton, Comments Inorg. Chem. 3 (1985 321-348. 2 P.G. Schultz, J.S. Taylor, P.B. Dervan, J. Am. Chem. Soc. 104 (1982 6861-6863. 3 M. Gielen, E.R.T. Tiekink (Eds., Metallothera

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22、han, R. Vijayalakshmi, V. Subramanian, B. U. Nair, Bull. Chem. Soc. Jpn., 2002, 75, 11431149 7 Tomohide T. K., Keiko T., Atsushi K., et al., Bull. Chem. Soc. Jpn.,70:615-629(1997 8 J.A. Cowan, Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001 634-642. 9 L.N. Ji, X.H. Zou, J.G. Liu, Coord. Chem. Rev. 216-217 (2001 513

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