加拿大原产地西洋参多糖提取工艺优化研究_任烨

1、第37卷第6期 西南民族大学学报·自然科学版Nov. 2011Journal of Southwest University for Nationalities Natural Science Edition_收稿日期:2011-09-05联系作者:刘圆(1968-, 女, 重庆忠县人, 教授, 博士, 副院长, 主要从事少数民族药物的研究和教学工作. E-mail:yuanliu163.基金项目:国家外专局外国文教专家重点项目(2010; 四川省杰出青年学术技术带头人后续计划(2011JQ0051.文章编号: 1003-2843(201106-0940-06 加拿大原产地西洋参多糖

2、提取工艺优化研究任烨1, 李厚聪2, 刘永恒1, 黄艳菲1, 李艳丹1, 丁玲1, 彭镰心3, 刘圆1(1.西南民族大学少数民族药物研究所, 四川 成都 610041; 2. 湖北民族学院医学院, 湖北 恩施 445000;3.成都大学生物产业学院, 四川 成都 610106摘 要: 目的筛选加拿大原产地西洋参多糖的最佳提取工艺条件。方法单因素和正交试验法。结果加拿大原产地西洋参多糖的最佳提取分离工艺为:加热回流法, 药材粒径为65目的西洋参粉末加入25倍体积80 %乙醇90 回流1 h, 提取2次, 滤渣减压干燥后按照料液比为1:35加水浸泡3 h, 100 提取1 h, 提取3次。结论为加

3、拿大原产地西洋参多糖的提取分离条件提供了参考, 为加拿大原产地多糖西洋参的进一步开发研究提供依据。关键词:西洋参; 加拿大原产地; 多糖; 提取工艺; 正交设计中图分类号: R284.2; R93 文献标识码:Adoi :10.3969/j.issn.1003-2483.2011.11.18西洋参为五加科人参属植物Panax quinquefolium L.的干燥根1。西洋参原产北美洲的加拿大南部和美国北部, 分布于北纬3040度, 西经67125度范围, 在中国多省栽培成功, 其中东北三省、陕西秦巴山区普遍栽培。西洋参多糖(PPQ是西洋参中含量最多的一类具有特殊生物活性的物质; 西洋参及其提

4、取物的可溶性果胶中均含有一定的多糖类成分, 目前分离出来的成分有蔗糖、人参三糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等2。西洋参多糖在西洋参根中含量达10% 左右, 现代药理研究表明具有增强免疫、降血糖、抗辐射、抗肿瘤、益智等作用3-5。目前, 关于西洋参多糖水提取工艺研究的文献报道较少, 张仁权6等报道了西洋参参须废渣中参多糖的提取及含量测定, 但并没有对西洋参多糖提取工艺进行优化筛选。本文拟对自采于加拿大原产地西安大略省大山行农场的西洋参为原料, 对多糖提取进行单因素和正交试验考察, 确定最佳水提取工艺参数, 为原产地西洋参的进一步研究提供一定的

5、科学实验数据。 1 材料与仪器1.1 药材来源2009年6月20日自采于加拿大原产地西安大略省大山行农场, 经西南民族大学少数民族药物研究所刘圆教授鉴定为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根。切断, 55 烘干, 粉碎, 过26号药典筛后分装于自封袋中, 置于干燥器中保存, 备用。1.2 试剂D 型葡萄糖对照品购于成都市药品检验所, 无水乙醇、蒸馏水、蒽酮、浓硫酸均为分析纯。1.3 仪器Unican UV-500紫外分光光度计, METTLER AE240S 型电子天平(梅特勒-托利(上海有限公司, 800型离心沉淀器(上海手术机械厂, 数显恒温水浴锅(国华电器

6、有限公司, 艾柯AKRY-UP-1824型超纯水机(成都康宁实验专用纯水设备厂, SHZ-D(III型循环水真空泵(天津华鑫仪器厂。第6期 _任烨 等: 加拿大原产地西洋参多糖提取工艺优化研究 图1 多糖得率与提取时间关系图2 方法2.1 加拿大原产地西洋参提取工艺流程原料药西洋参打粉过筛乙醇回流除杂质滤渣蒸馏水提取抽滤滤液离心上清液定容UV 测定吸光度。2.2 加拿大原产地西洋参多糖的含量测定-蒽酮比色法2.2.1 蒽酮-硫酸溶液的配制精密称取蒽酮0.2 g, 缓慢加入100 ml 浓硫酸, 边加边搅拌至蒽酮全部溶解呈黄色透明液, 避光保存, 现用现配。2.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制精密称

7、取在105下恒温干燥至恒重的葡萄糖0.05007g 置100ml 容量瓶中, 加蒸馏水溶解至刻度, 配制成 0.5007mg/ml 的标准溶液。分别精密吸取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 ml 置10 ml 容量瓶中, 用蒸馏水稀释至刻度, 摇匀得葡萄糖系列标准溶液。精密吸取葡萄糖系列标准溶液各2 ml 至具塞比色管中, 沿着试管壁缓慢加入5 ml 蒽酮-硫酸试剂, 振摇, 冰水浴中冷却10 min, 取出, 100 沸水浴中加热显色10 min, 再置于冰水浴中冷却10 min, 另取蒸馏水用上述相同方法配制的溶液为空白对照。在620 nm 处测定吸光度。以浓

8、度C(mg/ml 为横坐标, 吸光度A 为纵坐标绘制标准曲线, 得到回归方程:A= 10.514C+0.0268, R 2 = 0.9996(n=8。葡萄糖含量在0.0100140.140196 mg/ml 范围内呈良好线性关系。2.2.3 加拿大原产地西洋参供试品溶液的制备精密称取西洋参粉1.0 g, 置于100 ml 圆底烧瓶中, 加入80 %浓度乙醇25 ml, 90 水浴回流1 h, 过滤, 重复提取1次, 残渣用80 %浓度乙醇2 ml 洗涤两次, 收集残渣挥干, 加入30 ml 蒸馏水浸泡一定时间, 在100 下水浴加热回流, 过滤, 收集滤液, 重复提取1次, 滤渣用2 ml 蒸

9、馏水洗涤2次, 合并滤液。离心(4000 r/min, 10 min , 回收上清液, 置于100 ml 容量瓶中加蒸馏水定容为供试品母液。精确吸取4 ml 供试品母液置于25 ml 容量瓶中, 加蒸馏水定容, 作为供试品溶液备用。2.2.4 多糖含量的测定按照2.2.3项下方法制备加拿大原产地西洋参供试品溶液, 精密吸取供试品溶液2ml 置于具塞比色管中, 同标准曲线显色操作, 于紫外可见分光光度计测定吸光度值, 根据回归方程计算出样品溶液中多糖的含量, 按下式计算样品中西洋参多糖含量。多糖得率(%=样品溶液中多糖含量(mg/西洋参粉末的质量(mg×100%3 结果3.1 单因素实

10、验结果3.1.1 提取时间的选择精密称取西洋参药材粉末(65目1.0 g, 80%乙醇25ml 90水浴回流1h, 过滤, 重复1次, 滤渣按料液比1:20(W :V加入蒸馏水20ml, 浸泡3h, 按照不同的提取时间100水浴回流提取, 重复1次, 按“2.2.4”项下方法进行测定, 多糖得率与提取时间关系见图1。试验结果表明:当提取时间为1 h 时多糖得率达到最大, 因此, 选择提取1h 。 西南民族大学学报·自然科学版3.1.2 提取次数的选择精密称取西洋参药材粉末(65目1.0 g , 加入80 %乙醇25 ml 90 水浴回流1 h, 过滤, 重复1次, 滤渣按料液比1:2

11、0( W:V加入蒸馏水20 ml, 浸泡3 h, 按照不同的提取次数100 水浴回流提取, 1 h/次, 按“2.2.4”项下方法进行测定, 多糖得率与提取次数关系见图2。试验结果表明:多糖含量在提取2次时到达最大值, 因此, 选择提取2次。 图2 多糖得率与提取次数关系图3.1.3 药材粒径的选择称取不同粒径(26号药典筛的西洋参药材粉末1.0 g, 80 %乙醇25 ml 90水浴回流1h后过滤, 重复1次, 滤渣按料液比1:20( W:V加入蒸馏水20 ml, 浸泡3 h, 100 水浴回流提取, 重复1次, 1 h/次, 按“2.2.4”项下方法进行测定, 多糖得率与药材粒径关系见图3

12、。试验结果表明:随着药材粒径的减小, 药材与提取液的表面积增大, 多糖得率逐渐升高, 但是药材粒径过小不仅不利于过滤处理而且会增大药材的损耗, 基于药材粒径对多糖得率的影响不大和工业生产中节约成本和减少损耗的因素考虑, 建议选择药材粒径达到中粉标准的65目(4号药典筛。 图3 多糖得率与药材粒径关系图3.1.4 浸泡时间的选择精密称取65目西洋参药材粉末1.0 g, 80 %乙醇25 ml 90 水浴回流1 h, 过滤, 重复1次, 滤渣按料液比1: 20( W:V加入蒸馏水20 ml, 按照不同浸泡时间浸泡, 100 水浴回流提取, 重复1次, 1 h/次, 按“2.2.4”项下方法进行测定

13、, 多糖得率与浸泡时间关系见图4。试验结果表明:随着浸泡时间的增加, 多糖得率先增加后减少, 浸泡2 h时有最大值, 因此, 选择浸泡时间为2 h。第6期 _任烨 等: 加拿大原产地西洋参多糖提取工艺优化研究 图4 多糖得率与浸泡时间关系图 3.1.4 料液比的选择精密称取65目西洋参药材粉末1.0 g, 80 %乙醇25 ml 90 水浴回流1 h, 过滤, 重复1次, 滤渣按不同料液比加入不同体积的蒸馏水, 浸泡2 h, 100 水浴回流提取, 重复1次, 1 h/次, 按“2.2.4”项下方法进行测定, 多糖得率与浸泡时间关系见图5。试验结果表明:随着溶剂的不断增加, 多糖的溶出先增加后

14、减少, 在W :V 为1:30时有最大值, 因此选择料液比W :V 为1:30。 图5 多糖得率与料液比关系图 3.2 正交实验结果根据单因素考察的结果, 初步确定选择提取时间、浸泡时间、料液比、提取次数等参数的范围, 设计L 9(34的正交试验, 每个试验重复3次, 取平均值作为结果, 对回流提取工艺进行优化, 因子水平设计见表1,正交试验结果见表2。表1 正交因子水平表L 9(34 水平 A B C D提取时间/min 浸泡时间/h 料液比(g/V 提取次数/次1 452 1:251 2 60 3 1:30 23 754 1:35 3 西南民族大学学报·自然科学版表2 正交实验结

15、果L9(34试验号 A B C D 多糖得率(%提取时间/min浸泡时间/h 料液比(g/V 提取次数/次1 1(45min 1(2h 1(1:25 1(1次 2.8492 1(45min 2(3h 2(1:30 2(2次 6.1003 1(45min 3(4h 3(1:35 3(3次 8.5734 2(60min 1(2h 2(1:30 3(3次 10.6605 2(60min 2(3h 3(1:35 1(1次 5.6486 2(60min 3(4h 1(1:25 2(2次 6.5467 3(75min 1(2h 3(1:35 2(2次 7.6648 3(75min 2(3h 1(1:25

16、3(3次 9.7989 3(75min 3(4h 2(1:30 1(1次 4.638K1 17.522 21.173 19.193 13.135K2 22.854 21.546 21.398 20.310K3 22.100 19.757 21.885 29.031k1 5.840 7.057 6.400 4.380k2 7.620 7.183 7.133 6.770k3 7.367 6.587 7.293 9.677R 1.780 0.596 0.893 5.297最优 A2 B2 C3 D3表2正交试验极差结果分析表明:各因素对西洋参多糖提取效果的影响程度依次为:DACB, 即提取次数提取时

17、间料液比浸泡时间。因素B、C显著性差异较小, 说明浸泡时间和料液比对西洋参多糖水提取工艺无太大影响; 因素A有较显著性差异, 说明提取时间对西洋参多糖水提取工艺中多糖的含量有较大影响; 因素D有最为显著差异, 说明提取次数对西洋参多糖水提取工艺中多糖的含量有最大影响。由表2可知当4种因素组合为D3A2C2B1时得率最高; 根据k值的比较可知4种因素组合为D3A2C3B2时理论得率最高。通过验证试验最终得出D3A2C3B2为西洋参多糖最佳提取工艺, 即提取次数3次、提取时间1 h、液固比1:35、浸泡时间3 h, 西洋参多糖得率为11.254 %。将正交试验结果进行方差分析, 结果见表3。表3

18、方差分析结果误差来源SS f S F PB 0.594 2 0.297 1.000C 1.372 2 0.686 2.310 <0.05D 42.247 2 21.124 71.123F0.10(2,2=9.000, F0.05(2,2=19.000, F0.01(2,2=99.000表3结果表明, D因素对结果的影响最显著, A、B、C因素对结果的影响不显著, 这与极差分析结果相同。4 讨论本次实验对加拿大原产地西洋参多糖水提取工艺进行了优化, 采用紫外可见分光光度法, 以西洋参多糖水提液吸光度为评价指标进行了研究, 其他提取方法对西洋参多糖提取率的影响以及对各种理化性质的影响需要进一

19、步进行研究讨论。通过单因素试验设计, 在此基础上设计4因素3水平的正交试验对加拿大原产地西洋参多糖水提取工艺的优化, 得到其最佳提取工艺为:样品粒径65目, 料液比1:35, 浸泡3 h, 100 下1 h/次, 提取3次。在最佳条件下加拿大原产地西洋参的多糖得率为11.254 %。使用优化的方法可以提高西洋参多糖的提取率, 其结果可为加拿大原产地西洋参多糖提取的工业化生产提供一定的理论参考依据。945 任烨 等: 加拿大原产地西洋参多糖提取工艺优化研究 第6期 _ 参考文献： 1 2 3 4 5 6 中华人民共和国国家药典委员会.中国药典. 一部M. 2010 版. 北京: 中国中医药科技出

20、版社, 2010:122-123. 李冀, 付雪艳, 郝娴. 西洋参多糖类物质研究进展J. 中医药信息, 2006, 23(4:15. 王红梅, 马玲. 西洋参的免疫调节作用研究进展J. 中国食品卫生杂志, 2002, 14(5: 42-43. 郑明权, 刘彦臣. 西洋参茎叶总皂苷和根多糖的药理学研究进展J. 中医药信息, 2000, (2: 12-13. 孟凡征, 李柏西洋参M. 北京: 北京科学技术出版社, 2003. 张仁权, 吕洁平, 陈怡. 西洋参参须废渣中参多糖的提取及含量测定J. 中药新药与临床药理, 2001,12(2:109-110. The optimization of

21、water extraction technology of polysaccharide from Panax quinquefolium L. collected from original place in Ontario of Canada by single factor and orthogonal designed method REN Ye1, LI Hou-cong2, LIU Yong-heng1, HUANG Yan-fei1, LI Yan-dan1, DING Ling1, PENG Lian-xin3, LIU Yuan1 （1. .Ethnic Pharmaceu

22、tical Institute of Southwest University for Nationalities, Chendu 610041, P.R.C.; 2.Medical School of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, P.R.C ; 3.Faculty of Biotechnology Industry, Chengdu University, Chendu 610106, P.R.C） Abstract: Objective：To screen the water extraction technology of total polysaccharide from Panax quinquefolium L. collected from original place in Ontario of Canada Methods：Single facto