龙腾胶囊有效提取物对实验动物炎症和免疫反应的影响

1、龙腾胶囊有效提取物对实验动物炎症和免疫反应的影响    【关键词】 龙腾胶囊    Effects of effective extractive of Longteng Capsule on inflammation and immune reaction in rats 【Abstract】 AIM: To study the therapeutic effects of the effective extractive of Longteng Capsule on inflammation and immun

2、e reaction in rats. METHODS: Three types of inflammatory animal models were used: acute inflammatory edema of paws, Freunds adjuvant arthritis and chronic granuloma. T cell subpopulation in rats was measured by flow cytometry. ELISA assays were performed to determine serum IL1 and IL2. RESULTS: The

3、extractive inhibited the edema of inflammatory tissue, relieved adjuvant arthritis and inhibited chronic granuloma. Arthritis score was (4.1±0.3) on 27 d. The serum IL1 and IL2 levels were significantly reduced to (60±6) and (175±90) g/kg. CONCLUSION: The extractive of Longteng Capsul

4、e has some immunosuppressive and antiinflammatory effects on the experimental models used in our study, possibly by reducing the release of cytokines such as IL1 and other inflammatory mediators. 【Keywords】 plant extractions; Longteng Capsule; inflammation; immune; IL1;IL2 【摘要】 目的：研究龙腾胶囊的有效提取物在炎症动物模

5、型水平的抗炎和抑制免疫反应的作用. 方法：制作三种不同的炎症模型：大鼠足爪肿胀，棉球肉芽肿，佐剂性关节炎，运用ELISA，流式细胞术，物理检测等方法，检测用药后对IL1，IL2，T细胞增殖等指标的影响. 结果：提取物对大鼠的足爪肿胀，棉球肉芽肿，佐剂性关节炎有明显的抑制作用，关节炎评分在27 d为4.1±0.3，对佐剂性关节炎的滑膜病变也有明显的改善作用. IL1，IL2水平下降为(60±6)和(175±90) g/kg，CD8 细胞减少，CD4 /CD8 的比值减少. 结论：龙腾胶囊有效提取物有抗炎和抑制免疫的作用. 【关键词】 植物提取物; 龙腾胶囊；炎症;

6、免疫; IL1; IL2 0引言 在寒冷地区，我军常用民间古方龙腾胶囊治疗关节炎,疗效较好. 龙腾胶囊由穿山龙和南蛇藤制成，而南蛇藤属于卫矛科植物，具有抗炎、抗菌、抗病毒等活性1，含生物碱、菇类、强心甙及Z黄酮类化合物，主要是B二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯和生物碱,此外还有三萜类、黄酮类、有机酸类、多元醇类、甾体类及鞣质2. 我们研究提取物的治疗作用及其作用机制. 1材料和方法 11材料 龙腾胶囊及其有效提取物由第三军医大学药理教研室新药研究所提供.SD大鼠, ,清洁级,实验初始体质量140160 g,购自第三军医大学试验动物中心；角叉菜胶购自Sigma公司；吲哚美辛购自Sigma公司；弗氏完全佐

7、剂(FCA)；RAT CD82PE和RAT CD42FITC mAb (美国Beckman Coulter公司);大鼠IL1和IL2 ELISA试剂盒(北京邦定生物技术有限公司);卡介苗购自上海生物制品公司；MK2500型足爪容积测量仪(日本产)； 流式细胞计数仪(Becton Dickinson公司). 12方法 大鼠180只,每种模型分为6组：正常组(模型不予处理);阴性对照组：生理盐水;阳性对照组：吲哚美辛;高中低剂量组. 龙腾胶囊提取物0.5, 1.5和4.5 g/kg, ig,每组10只. 角叉菜胶诱发大鼠足爪肿胀,    给药后1.5 h,在

8、大鼠右后足跖sc 10 g/L角叉胶01 mL, 致炎后15 h，每小时用窄带尺分别测量左右踝关节周径，以其差值作为肿胀度； 致炎前1.5 h ig给药1次. 大鼠棉球肉芽肿, 乙醚麻醉，肩胛部皮肤碘酊消毒，乙醇脱碘，肩胛间切一1 cm的切口，止血钳钝性分离两侧皮肤与皮下组织，切口两侧皮下各植入消毒棉球（20 mg） 1个，缝合切口； 术后当日开始给药，连续7 d. 佐剂性关节炎, 取无水羊毛脂与液体石蜡,比例为46. 加温搅拌、高压消毒后,保存备用. 使用时加入卡介苗(上海生物制品厂) ,使每mL含灭活的结核杆菌10 mg,而制成完全弗氏佐剂. SD大鼠乙醚麻醉下用750 mL/L的乙醇消毒

9、后,在尾根部皮下分34点注射完全弗氏佐剂,清醒后单笼饲养,自由进食和饮水,每日观察和记录注射部位、尾部和肢体关节部位的变化,并测量其体质量3. 于佐剂注射后1 wk开始给药，连续7 d. 评分标准, 0:正常;1分: 1个或1个以上趾关节红肿; 2分:整个足爪红肿;3分:踝关节以下红肿;4分:包括踝关节在内的全部足爪红肿. 每只大鼠4只足爪的最大积分为16分4. 对照药吲哚美辛：10 mg/kg, 针对不同模型，给药方案同上. 造模后28 d摘眼球取血,分离血清. 采用双抗夹心ELISA法检测IL1，IL2含量. 用小鼠脾细胞检测对淋巴细胞体外增殖的影响：流式细胞术(flow cytometr

10、y, FCM)检测T淋巴细胞亚群大鼠脾淋巴细胞悬液200 L, 2000 r/min离心5 min,弃上清,压积细胞中加入CD42FITC和CD82PE mAb各20 L,另设非特异性染色对照,置4反应30 min. 流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群. 观察模型3踝关节局部的病理变化，同时观察胃黏膜的变化. 滑膜病理学检测: 给药24 d处死动物,打开膝关节腔取出滑膜,切片HE染色. 按滑膜病理评分法(炎细胞浸润, 0:无炎性细胞; :稀疏散在; :较密集; :大量. 纤维组织增生, 0:无纤维组织增生; :少量增生; :中等增生; :大量. 滑膜细胞增生, 0:无滑膜细胞增生; :单层细胞肿胀密

11、集; :二层细胞肿胀密集; :三层细胞肿胀密集. 巨噬样A细胞增生, 0:无巨噬样A细胞; : 稀疏散在; : 较密集; :大量)进行评分并对每组各项评分进行累加. 胃黏膜炎症分级积分参照Rauws分级标准5: 黏膜固有层炎症细胞(单核细胞) 浸润的密度(02分);黏膜固有层嗜中性多核粒细胞浸润的密度(03分);黏膜上皮内嗜中性多核粒细胞的密度(03); 浅表糜烂的程度(02分);对每个参数,0是没有,1分是轻度,2分是中度,3分是重度. 应用总积分010分的变化来衡量胃炎的程度.    统计学处理： 结果以x±s表示. 采用SPSS 10.0

12、统计软件进行单因素方差分析(One Way ANOVA)及LSDt两两比较. 2结果 21足爪肿胀模型在龙腾胶囊治疗组，炎足肿胀率及炎足增重率均较阴性治疗组和正常组有明显的降低(P<0.05). 而中高剂量对肿胀的抑制更为明显,与吲哚美辛的抑制率相近(Tab 1).表1龙腾胶囊有效提取物对角叉菜胶诱发大鼠足爪肿胀模型的影响（略）    22棉球肉芽肿正常组和阴性对照组肉芽肿质量分别为(63.0±5.7) mg和(62.0±6.1) mg，而高中低剂量治疗组分别为(38.4±3.6), (39.6±4.1)和(

13、46.6±4.9) mg；吲哚美辛组为(37.6±5.6) mg. 龙腾胶囊治疗组肉芽肿质量较阴性治疗组和正常组有明显降低(P<0.01). 而中高剂量对肿胀的抑制更为明显,与吲哚美辛组的抑制率相近. 23佐剂性关节炎与阴性对照组比较,运用龙腾胶囊后4 d (d 15)高剂量组有明显的抗炎作用(P<0.05, Tab 2),停药4 d (d 27)后抑制作用仍存在,不出现反弹,对继发性足肿胀的抑制作用与阳性药相当. 中剂量组给药后8 d(d 19)对继发性足肿胀有明显的抗炎作用(P<0.01),停药后4 d(d 27)抑制作用依然存在. 而低剂量组从炎症发

14、病的最高峰d 21到停药后2 d(d 25)对继发性足肿胀有明显的抑制作用(P<0.01). 龙腾胶囊治疗组关节炎评分明显低于对照组(Tab 2). 模型组大鼠滑膜炎细胞浸润、滑膜细胞增生、纤维组织增生显著增高,未见巨噬样A细胞增生;与模型组比较, 龙腾胶囊有效提取物治疗组炎细胞浸润、滑膜细胞增生和纤维组织增生程度明显减轻(Tab 3, Fig 1, 2).表2龙腾胶囊有效提取物对大鼠佐剂性关节炎的影响（略）表3关节滑膜病理观察（略） 24IL1，IL2水平在正常组和阴性对照组分别为(106±11)和(308±122) g/kg；(105±10)和(306&

15、#177;135) g/kg. 而低剂量治疗组下降为(71±10)和(171±88) g/kg，而中高剂量组下降更低(P<0.01, Tab 4).表4龙腾胶囊有效提取物对大鼠佐剂性关节炎血清中IL1，IL2含量的影响（略） 25淋巴细胞增殖造模后28 d阴性对照组CD4 增加,CD8 明显降低(P<0.05), CD4 /CD8 比值比正常组显著增加(P<0.05), 低中剂量CD4 没有明显变化,而高剂量组及阳性药组CD4 有显著增加;低中剂量组及阳性药组CD8 有显著增加,而高剂量没有明显变化;与阴性对照组相比较,高剂量组CD4 与CD8 的比值显示

16、显著增加(P<0.05),而低中剂量和阳性药组的CD4 与CD8 的比值虽有增加,但统计学上无显著性(Tab 5).表5大鼠佐剂性关节炎模型中龙腾胶囊有效提取物对大鼠淋巴细胞亚群的影响（略） 3讨论 在寒冷地区，我军的原铁道兵部队及海军，经常有患关节炎的，常用民间古方龙腾胶囊治疗,而且取得了较好的疗效.而在这些部队的患者中,风湿性关节炎和类风湿性关节炎皆有,以风湿性关节炎为主.因为风湿性关节炎为急性的风湿热疾病,而类风湿性关节炎则为慢性的全身性炎症反应,而两者都是以炎症反应为基础. 我们观察了龙腾胶囊有效提取物对试验大鼠体内IL1,IL2水平的影响,结果发现, 龙腾胶囊有效提取物可使大鼠

17、体内过高的IL1,IL2水平明显下降,呈一定的剂量依赖性. 而有文献证明南蛇藤的提取物可以降低IL1，NOS，NFB在体内的水平6. 提示,该药对大鼠的治疗作用与其降低TNF2,从而抑制IL1，IL2的分泌有直接关系.    我们还发现,佐剂性关节炎模型组的CD8 与正常组相比显著降低,CD4 与CD8 比值与正常组相比显著增加,与文献报道一致. 但是, 龙腾胶囊有效提取物对大鼠异常的CD4 与CD8 比值并没有明显的改善. 总之, 龙腾胶囊是通过它的有效提取成分起到了治疗关节炎的作用.而其可能通过降低体内的IL1，IL2水平,抑制其他炎性因子的产生,影

18、响淋巴细胞的增殖等来发挥抗炎，抑制免疫的作用. 【参考文献】 1 Chang FR，Hayashi K，Chen IH,et al. Pristimerin induces caspasedependent apoptosis in MDAMB231 cells via direct effects on mitochondriaJ. J Nat Prod，2003；66（11）：1416-1420. 2 Jin HZ, Hwang BY, Kim HS, et al. Antiinflammatory constituents of Celastrus orbiculatus inhibit the NFkappaB activation and NO productionJ. J Nat Prod, 2002;65(1):89-91. 3 戴丽,黄慧伟,彭聿平.自身免疫性疾病动物模型佐剂性关节炎的制备J. 交通医学,2001;15(6):616-617. Dai L, Huang HW, Peng YP. Adjuvant arthritis as an animal model of autoimmune diseaseJ. Traffic Med,2001;15(6):616