中药黄连有效成分盐酸小檗碱与牛血清白蛋白的相互作用

1、Vol.25高等学校化学学报No.112004年11月CHEM ICAL JOU RNAL OF C HINESE UNIVERSITIES20992103中药黄连有效成分盐酸小檗碱与牛血清白蛋白的相互作用刘雪锋,夏咏梅,方云,刘玲玲,邹鲁(江南大学化学与材料工程学院,无锡214036摘要从天然中药材黄连中提取分离并精制得到盐酸小檗碱(BC,采用U V光谱和荧光光谱(FS研究其与牛血清白蛋白(BSA的相互作用,解释了BC导致BSA的荧光发射光谱峰裂分的现象,其二重峰分别归属于色氨酸及酪氨酸残基.结果表明,静态猝灭和非辐射能量转移是导致BC对BSA荧光猝灭的两大原因, BC与BSA的表观结合常数

2、K A为8.66×104L/mol(30和8.72×104L/mol(37,BC在BSA分子上的结合位点数为(3.1±0.2.BC与BSA分子中荧光性氨基酸残基之间的距离为3.75nm(30和3.62nm (37,表明BC的部分片段能够插入BSA分子内部.热力学函数计算结果表明,该作用过程是一个熵增加、G ibbs自由能降低的自发超分子作用过程,并由此推断BC与BSA之间以疏水相互作用为主.关键词荧光光谱法;中药有效成分;黄连;盐酸小檗碱;牛血清白蛋白中图分类号O648.162文献标识码A文章编号0251-0790(200411-2099-05化学小分子与生物大分

3、子的相互作用是当前生命科学领域经常遇到的主要化学问题之一.血清白蛋白是生命体血浆中含量最丰富的蛋白质,具有贮运内源代谢产物和外源药物小分子(离子等重要生理功能.对各类物质与生物大分子的作用已有较多报道16,目前比较关注中药有效成分与生物大分子的相互作用7,8.小檗碱(黄连素是我国名贵中药材黄连的主要有效成分,具有抗菌消炎等作用,在原小檗属植物中广泛分布,临床上通常使用盐酸小檗碱或盐酸黄连素(Berberine chloride,BC.BC与人血清白蛋白(HSA的表观结合常数已有报道9,但尚未见到有关荧光发射光谱峰裂分现象的阐释以及确定BC在蛋白质分子上的结合位点数和结合位置的研究报道.本文从天

4、然中药材黄连中提取分离并精制得到BC,用UV光谱和荧光光谱(FS研究其与牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA的相互作用,解释了BC导致BSA的荧光发射光谱峰裂分现象及二重峰的归属;确定静态猝灭和非辐射能量转移是导致BC对BSA荧光猝灭的两大原因;由Lang muir单分子吸附模型与质量作用定律推得相互作用的数学模型,求得BC对BSA的表观结合常数K A及结合位点数n;证实BC的部分片段能够插入BSA分子内部,并从热力学函数计算推得BC与BSA之间以疏水相互作用为主.1实验部分1.1试剂与仪器黄连(生药材,宁波双林中药饮片公司,牛血清白蛋白(99.0%,BSA Frac

5、tion V,Sino-American Biotechnolog y Co.,Tris(生化试剂,上海化学试剂公司,亚沸蒸馏水(电导率7.8×10-7S/cm,自制,高纯N2气(99.99%,无锡炼钢厂,其它所用试剂均为分析纯.RF5301PC型荧光光度仪(Shi-madzu公司,UV1100型紫外光谱仪(北京普析通用仪器有限责任公司.1.2BC的提取分离与鉴定取10g黄连粗粉,用250mL×4无水乙醇抽提,浓缩抽提液并加入浓盐酸得约2g黄色沉淀.用收稿日期:2003-09-16.基金项目:江苏省自然科学基金(批准号:BJ99036资助.联系人简介:方云(1957年出生,

6、男,教授,博士生导师,主要从事胶体与界面化学及酶催化研究.E-mail:fangyunzhou Scheme 1Molecular structure of berberine chl oride沸水溶解,热滤,取滤液加盐酸调pH =2使其重结晶.将晶体用水洗至刚果红试剂不变色,干燥后得BC (结构见Scheme 1约0.5g,m.p.183.5184.0,反相HPLC 归一化纯度>98.0%,UV ,IR 及NM R 图谱均与Sadtler 标准图谱吻合.1.3光谱实验方法以T ris-HCl 缓冲液(pH=7.4,含0.15m ol/L NaCl 以维持溶液离子强度为溶剂配制1.0&

7、#215;10-5mol /L 的BSA 标准溶液备用.BC 用无水甲醇配成2.0×10-3mol /L 的标准溶液备用.在50mL 三角瓶中精确移入一定量的BC 甲醇标液,以高纯N 2气吹赶甲醇至干,再加入BSA 溶液10mL,超声分散5min 后,于30或37恒温3h.激发光栅及发射光栅狭缝宽均为3nm,激发波长295nm ,恒温(30或37测定上述样品在300500nm 的荧光发射光谱.以Tris -HCl 缓冲液为溶剂配制1.0×10-5mol /L 的BC 溶液,恒温(30或37测定其在300500nm 的U V 吸收光谱.2结果与讨论2.1BC 对BSA 内源性

8、荧光和分子构象的影响BSA 分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基能发射荧光,所以BSA 是内源性荧光物质.图1 表Fig .1Ef fect of berberine chloride on f luorescencespectra of BSA at 37c (BSA: 1.0×10-5mol/L;105c (BC /(m ol L -1from peaksa to h :0,0.375,0.75, 1.0, 1.5, 2.25,3.0and 4.5.明BC 可猝灭BSA 的内源性荧光,证明BC 与BSA之间存在相互作用.由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸残基在蛋白质分子内部的空间距离为

9、710nm ,彼此之间的共振能量转移会导致酪氨酸及苯丙氨酸残基的荧光猝灭10,所以在大多数情况下,蛋白质的FS 图似乎只显示色氨酸残基的荧光,其峰值在343nm 附近11.当BC 浓度在1.0×10-5mol/L 以下,BSA 在343nm 处的荧光发射只因猝灭而导致荧光强度降低,但峰形及峰位置无明显变化.当BC 浓度达1.0×10-5mol/L 以上时,BSA 的荧光发射强度继续随BC 浓度增大而逐渐降低,同时显现峰裂分,即原来343nm 处的单峰逐渐裂分为二重峰,其中一峰峰值蓝移,另一峰峰值红移.图1的峰裂分现象目前鲜有报道9,且对二重峰的归属尚无解释.图2(A 的同步

10、荧光结果表明,当BC 浓度增大时,BSA 中色氨酸残基产生荧光的强度降低且峰位置红移,因此图1中红移峰应归属于色氨酸残基.基于以下实验事实,可推断蓝移峰可能是由酪氨酸残基产生的:(1HSA 中只含有W 214,而不含有W 135色氨酸残基,但BC-HSA 体系中也出现类似图1的峰裂分现象9,故可排除蓝移峰是BSA 分子中W 135残基产生的可能性;(2蓝移峰强度随BC 浓度增加而降低,排除此峰为BSA -Fig .2Synchronous f luorescence spectra of BSA c (BSA: 1.0×10-5mol/L ;105c (BC/(mol L -1fro

11、m a to c :0,0.75and 1.5.(A =60nm ;(B =15nm.2100高等学校化学学报V ol.25BC 复合物产生的可能性;(3苯丙氨酸的荧光峰值位于282nm 附近10,排除此峰为苯丙氨酸残基产生的可能性;(4图2(B中酪氨酸的荧光峰在305nm 附近且荧光强度随BC 浓度增加而降低,最接近图1中蓝移峰的变化趋势.因此,图1中的蓝移峰最可能是BSA 中酪氨酸残基受BC 诱导而终止与色氨酸残基间的共振能量转移,分裂出自身的荧光发射峰,其最大发射波长蓝移则表明酪氨酸残基所处微环境的疏水性增强5.蛋白质在343nm 处的荧光峰传统上被归属为色氨酸残基10,但从其半高峰宽超

12、常的峰形和BC 存在时的峰裂分现象看,该宽峰应对应于蛋白质分子中所有荧光性氨基酸残基.2.2BC 对BSA 内源性荧光猝灭作用机理对于不出现荧光发射峰裂分现象的蛋白质荧光猝灭体系,一般采用指定波长处的相对荧光强度I 与猝灭剂浓度c Q 之间的变化关系式来描述或评价荧光猝灭过程;但对于存在峰裂分的体系,以荧光发射总量S (荧光发射峰面积与猝灭剂浓度c Q 之间的变化关系来描述或评价荧光猝灭过程12更合理.BC 对BSA 荧光猝灭过程若是动态猝灭,其作用过程应遵循Stern-Volmer 方程12:S 0/S =1+K S V c D,t(1式中,S 0是BSA 溶液的荧光发射总量,S 是加入BC

13、 后BSA 溶液的荧光发射总量,c D,t 是BC 的总浓度(mol/L.K S V 是Stern-Volmer 猝灭常数(L/m ol,且由下式定义:K S V =k q × 0(2式中,k q 是由扩散过程控制的双分子动态猝灭速率常数(L mol -1s -1, 0是生物大分子内源性荧光寿命,本文取 0=10-8s 13.将BC 对BSA 的荧光猝灭数据(37按式(1处理作图得图3,从图3中直线部分线性拟合得到K SV =3.46×104L/mol(R 2=0.9902.由式(2得到猝灭常数k q =3.46×1012L mol -1s -1,此值远大于各种猝

14、灭体对生物大分子的最大扩散猝灭常数(2×1010L m ol -1s -13,表明BC 对BSA 内源性荧光的猝灭过程不是由扩散控制的动态猝灭过程,而可能是静态猝灭过程3,并在BC 与BSA 之间形成了基态复合物.图4中BC 的UV 吸收光谱与BSA 的FS 发射光谱有相当程度的重叠,据Fo rster 无辐射能量转移理论13,BSA 与BC 之间存在着非辐射能量转移.因此,静态猝灭和非辐射能量转移是导致BC 对BSA 荧光猝灭的两大原因 .Fig .3Stern -Vol mer curves of f luorescencequenching of BC to BSA at 37

15、 Fig .4Overlap of BC absorption spectrum (a with BSA fl uorescence spectrum (b at 37a .c (BC=1.0×10-5mol/L;b .n (BC n (BSA=11.根据Forster 无辐射能量转移理论,当荧光给体与受体分子之间最大距离小于710nm ,且荧光给体的FS 发射光谱与受体的U V 吸收光谱存在相当程度的重叠时(图4,两者之间可发生能量转移,其效率E 与给体-受体之间的能量转移距离r 及E =50%时的临界距离R 0存在下列关系:E =R 60/(R 60+r 6(3E =1-S /S

16、 0(4R 60=8.8×10-25K 2N -4!p J (5式(5中,K 2为偶极空间取向因子,N 为介质折射指数,!p 为BSA 的荧光量子产率,J 为给体荧光发射光谱与受体吸收光谱的重叠积分J =(I p ( D ( 4 /(I p ( (6式中,I p ( 是BSA 在波长 处的荧光强度,D ( 是BC 在波长 处的摩尔吸光系数.据图4结果按照式(6得J =2.818×10-14cm 3L mol -1(30及2.819×10-14cm 3L mol -1(37.在本文实验2101N o.11刘雪锋等:中药黄连有效成分盐酸小檗碱与牛血清白蛋白的相互作用条

17、件下,取K 2=2/3,N =1.336,!p =0.1513,按式(5计算得R 0=3.03nm ,按式(4计算得E =0.2173(30及0.2561(37,进而得到r =3.75nm(30及3.62nm (37,表明BC 的部分片段能够插入BSA 分子内部.2.3BC 与BSA 的表观结合常数K A 以及结合位点数n药物小分子D 与生物大分子P 之间的相互作用满足下式:D +P k +k -D-P Complex (7设在一定药物浓度范围内每个大分子上存在n 个等同且独立的药物结合位点,且D 与P 之间相互作用关系符合Langm uir 单分子吸附模型14,15,当相互作用达到平衡状态时

18、,则有K A =c D,b /c D,f (nc P,t -c D,b (8式中,K A 为D 与P 之间的表观结合常数,c D,b ,c D,f 及c P,t 分别为被结合药物、游离药物以及生物大分子总浓度(mol /L ,n 为每个大分子上存在的小分子结合位点数.假定D -P 复合物不发荧光,则体系中各物种之间有下列定量关系式:c D,b /nc P,t =(S 0-S /S 0(9c D,t =c D,b +c D,f(10将式(9及式(10代入式(8,可得S 0/S =K A c D,t S 0/(S 0-S - nK A c P,t(11Fig .5The c D ,t S 0/(S

19、 0-S vs .S 0/S curves of BC and BSA system a .S 0/S =8.66×104c D,t S 0/(S 0-S -2.838,R 2=0.9963;b .S 0/S =8.72×104c D,t S 0/(S 0-S -2.552,R 2=0.9985.按照式(11对实验数据进行处理,结果见图5,线性拟合得到方程,再由方程斜率和截距可得表观结合常数K A 和结合位点数n (表1.表1数据表明,BC 与BSA 之间具有较强的相互作用,BSA 分子上具有(3.1±0.2个BC 的结合位点,故BC 能够被BSA 贮运.Tabl

20、 e 1The apparent association constant (K A andvalue of binding site (n in BC -BSA systemt /K A /(L mol -1n 308.66×104 3.3378.72×104 2.92.4BC 与BSA 之间相互作用的热力学参数以及作用力类型在温度变化范围不大时,若将BC 与BSA 之间的作用过程的焓变 H 作为一个不随温度改变的常数,则可由式(12(14得到BC 与BSA 结合过程的热力学参数 G , H 和 S ,结果列于表2.G =-RT ln K A(12 H =RT 1T 2l

21、n(K A 2/(K A 1T 2-T 1(13S =( H - G /T (14Tablet 2Thermodynamic parameters of the BC -BSA binding procedure t / H /(kJ mol -1 G /(kJ mol -1 S /(J mol -1K -1300.77-28.6497.06370.77-29.3297.06表2中 H 的数值与 G 的相比,可以按照 H 0处理.可见,药物BC 与BSA 之间是以非化学键形式相互作用的,药物分子BC 与BSA 分子的扦插以及BSA 分子构象的自发应激改变,使原本固定于BSA 的疏水空腔内部的部

22、分水分子得以释放,所以该作用过程是一个熵增加、Gibbs 自由能降低的自发超分子作用过程.根据热力学参数与作用力的关系16可知,BC 与BSA 之间以疏水相互作用为主.从BC 的分子结构(Scheme 1可知,BC 与BSA 之间也存在静电作用,但从作用过程热力学函数变化量 H 对 G 的贡献较小的实验事实判断,静电作用不是主要的,疏水作用是主要的,BC 与BSA 之2102高等学校化学学报V ol.25间的结合是熵驱动自发过程.参考文献1XU Hong (徐宏,DE NG Hong (邓洪,HU Hong -Yu (胡红雨et al .Chem .J .Chinese Universitie

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29、 chloride (BC ex tracted and purified from cop tis chinensis f ranch w as studied by using UV and fluorescence spectroscopy.The phe-nomenon that fluorescence spectra of BSA splitted and shifted from a simple peak to double peaks in the presence of BC w as ex plained ,and the double peaks responding