肾母细胞瘤裸鼠移植瘤模型的建立及其生物学特性-

1、本课题为国家自然科学基金资助项目作者单位:200032上海医科大学儿科医院外科(毕允力、高解春;上海肿瘤研究所(姚明实验研究肾母细胞瘤裸鼠移植瘤模型的建立及其生物学特性毕允力高解春姚明【摘要】目的采取手术标本,在裸鼠皮下连续传代建立人肾母细胞瘤裸鼠移植瘤模型。方法切取肾母细胞瘤患儿肿瘤组织植入裸小鼠右前肢皮下,连续传代。观测肿瘤生长,对各代移植瘤进行光镜和电镜观察,波形蛋白(vimentin及上皮膜抗原(EMA免疫组化染色,WT1基因检测。结果10个月中连续在裸鼠皮下传4代,总成瘤率为43%。移植瘤生长曲线与G ompentz函数符合。移植瘤保留了原肾母细胞瘤的组织学特征。Vimentin在各

2、代肿瘤细胞中均可见表达。而EMA在本肿瘤中均无阳性表现。图像分析结果提示各代移植瘤DNA指数及其细胞时相分布基本一致。WT1基因3段短重复序列长度在各代之间无变化。结论该模型基本保留了原肿瘤的生物学特性,是肾母细胞瘤基础及临床研究的良好模型。【关键词】肾母细胞瘤;疾病模型,动物;肿瘤移植;生物学Nude mice Wilmstumor modelB I Y unli,GA O Jiechun,YA O Ming.S hanghai Children Hospital, S hanghai Medical U niversity,S hanghai200032,China.【Abstract】O

3、bjectiveTo establish Wilmstumor model in nude mice by hypodermic inoculation of human Wilmstumor specimens.MethodsFresh human Wilmstumour s pecimens were sliced and inocu2 lated hypodermically into the forelimbs of nude mice.The tumor proliferation was monitored.Tumor sam2 ples were subjected to lig

4、ht and electronic microscopy examination and were immunostained for Vimentin and EMA.WT1gene expression was evaluated with PCR.R esultsDuring the10months period of study, 4generations of tumor divisions were recorded.The growth curve corresponded to the G ompentz function. The transplanted tumor cel

5、ls retained the original histological tumor character.Immuno-staining of Vi2 mentin was positive in each generation of tumor cells whereas that of EMA was negative.DNA index and cell cycle distribution were similar in each generation.The3end of WT1gene sequence remained intact in each generation.Con

6、clusionThe nude mice Wilmstumor model retains all the biological characteristics of the tumor and is suitable for Wilmstumor study.【K ey w ord】Nephroblastoma;Disease models,animal;Neoplasm transplantation;Biology肾母细胞瘤是小儿最常见的恶性肿瘤之一,其生物学特性和治疗实验一直是众多学者关注的热点。人恶性肿瘤的裸小鼠异种移植瘤模型是研究肿瘤形态、病理、生化代谢、染色体核型、细胞动力学及特

7、殊功能的重要方法1,但肾母细胞瘤裸鼠移植相对困难,文献报道较少,国内至今尚未建立该肿瘤的裸鼠移植模型。笔者首次在国内建立了人肾母细胞瘤裸鼠移植瘤模型,并通过形态观察、免疫组化、基因检测对其生物特性进行观察,报道如下。材料与方法1.人体肿瘤标本来源肿瘤组织来源于1例5岁女性肾母细胞瘤患儿。术中见肿瘤破溃,肠系膜淋巴结肿大,肾静脉内有瘤栓形成。病理学诊断为低分化间变型肾母细胞瘤,镜检见大量圆形及梭形的幼稚细胞,其基质呈粘液样。可见各种不同分化程度的上皮成分,排列成巢索状,幼稚细胞密集,伴有片状出血坏死。2.肿瘤移植与传代在无菌条件下切取患儿肿瘤组织在超净工作台上,将肿瘤组织切成2mm3小块,生理盐

8、水冲洗,用套管针植入BALB/C(n/ n雄性裸小鼠右前肢皮下,接种工作在标本离体后30min内完成。鼠龄6周,体重1820g。定期观察移植部位,待肿瘤长至直径12cm时,脊椎脱臼法处死裸鼠,用同样方法进行下一轮接种,每代6 40只不等,连续传代。因预实验及进一步实验需要,每代裸鼠数量不等。3.肿瘤生长测量定期观察肿瘤生长情况,记录肿瘤生长的潜伏期和肿瘤生长速度,当肿瘤直径达3mm时,定人每隔1周应用游标卡尺测量肿瘤的最大直径a及横径b,按公式V=/6ab2计算肿瘤体积。用指数函数先计算其生长速率K= (InV t-InV0/t,再计算其生长曲线及倍增时间Td =In2/K。4.病理组织学观察

9、处死及自然死亡的实验鼠,解剖并切取肿瘤以观察肿瘤镜下结构及浸润、各脏器转移情况,标本经体积分数为10%福尔马林固定,石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察。5.电子显微镜观察肿瘤组织样品用体积分数为2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定,7%蔗糖磷酸缓冲液冲洗再固定于体积分数为1%OsO4(锇酸中,丙酮逐级脱水,环氧树脂812号包埋,超薄切片,枸橼酸铅、醋酸铀双重染色,J EM1200透射电镜观察。6.免疫组化标记采用ABC法进行波形蛋白(vimentin和上皮膜抗原(EMA免疫组织化学定位,由肿瘤医院免疫病理室协助完成。一抗浓度: vimentin1500(DA KO公司,EMA1500(DA KO 公司

10、。7.图像分析仪检测DNA含量肿瘤标本用体积分数为10%福尔马林固定,石蜡包埋,23m切片,HE和Agure染色。采用图像分析仪测定50 100个细胞核,以同张切片间质淋巴细胞核DNA含量均数作二倍体对照,直方图形式打印输出DNA 指数(DI和A区域(G0和G1时相细胞,B区域(S 时相细胞和C区域(G2和M时相细胞的百分数。8.聚合酶联反应检测WT1基因取100mg 肿瘤组织,酚、氯仿肿瘤组织基因组DNA的抽提。以5AA TG A G ACTTACTGGGTG A GG3,5TTA2 CACA GTAA TTTCAA GCAACGG3扩增WT1基因3端短重复序列,PCR条件:于95100水浴

11、中预变性1015min;变性:909545s;退火:55 5845s;延伸:707245s,共35个周期,最后延伸10min,(均为Promega公司产品,操作步骤遵其产品说明。紫外光检测扩增条带。结果1.裸鼠及移植瘤的生长特点10个月中连续裸鼠皮下传4代,共移植裸鼠76只,移植1周内局部肿块逐渐消退,7周后肉眼见肿瘤逐渐增大。鼠间传代潜伏期为50d左右,第1代移植瘤6个,成瘤率100%(6/6,第2代21个,成瘤率42.9%(9/21,第3代9个,成瘤率44.4%(4/9,第4代40个,成瘤率40%(15/40,总成瘤率为43%。第2代长期饲养的4只荷瘤鼠平均生存中位数为223d,最长荷瘤时

12、间为261d。2.移植瘤组织动力学第2代4只荷瘤鼠连续观察12周,绘制生长曲线。曲线经潜伏期进入快速生长期后逐渐进入平台期。曲线与G ompentz函数符合。第2代荷瘤鼠肿瘤倍增时间见表1,随接种时间增加,倍增时间似有迅速增加趋势。表1第2代荷瘤鼠体积及倍增时间接种周数肿瘤体积(mm3倍增时间(d8135 5.309337 5.7510781 5.6811183521.9512228340.2513257243.9114286443.9115320160.3816348996.6017365069.00183908161.001940213.移植瘤的组织病理学显微镜下观察各代移植瘤细胞生长活跃

13、,各代之间细胞形态一致,间质细胞少见,细胞呈小圆形,核浆比例大,核染色深。保留了原肾母细胞瘤的组织学特征。镜检可见移植瘤周围结缔组织边界清楚,未见明显癌组织侵入周围组织。心、肺、肝等重要脏器病理未见肿瘤转移灶。4.透射电镜检查电镜下可见,肿瘤细胞极其丰富,细胞核密集、核大、不规则、核仁多、贴边、包浆少,可见核糖体及粗面内质网。所检测的第2、第4代移植瘤均有上述表现。5.免疫组化Vimentin在各代肿瘤细胞中均可见表达。而EMA这一上皮性标记在本肿瘤中均无阳性表现。与原肿瘤免疫组化结果一致。6.DNA图像分析图像分析结果(表2提示各代移植瘤DNA指数及其细胞时相分布基本一致,保持恶性肿瘤细胞的

14、生长特征。7.WT1检测原肿瘤与各代移植瘤WT1基因均无缺失,所检测的3端短重复序列长度在各代之间无变化(图1。 表2各代移植瘤DNA 指数与细胞时相分布分组DNA 指数细胞时相分布G0+G1S G2+M 原代1.5158.8232.358.821 1.8072.7327.2702 2.7871.4328.57031.8175.6824.32 14为各代肿瘤标本;5为患儿肿瘤标本;6为标准对照物图1各代肿瘤WT1电泳条带图讨论裸鼠移植瘤模型的出现大大提高了肿瘤异体移植成功率,简化了移植瘤制作过程。与体外细胞培养相比,移植瘤模型的建立和长期传代相对方便,不受成纤维细胞污染;更重要的是它保留了实体

15、肿瘤生长的特点,如肿瘤的增生受宿主的营养情况和血供的影响;而且能够同时观察肿瘤和宿主的相互影响。目前裸鼠移植瘤模型已成为化疗药物筛选的主要工具2。更有大量的文献报道了移植瘤在肿瘤病理形态、生化指标、肿瘤生长、肿瘤转移等方面的研究应用。建立人肿瘤裸鼠模型必须具备3点3:移植瘤能在动物体内持续增殖和长期传代,移植瘤的形态和功能与原人体肿瘤保持一致,从遗传学角度证明移植瘤来源于人体而非受体动物。研究发现,第1代移植瘤可建立长期传代模型的概率约为1/3,而第3代的可能性增加到90%。移植瘤在免疫缺陷的宿主中可能诱发自发瘤,但其发生率极低,仅约1.7%,多见的是淋巴网织系统肿瘤和肺腺癌4。可通过组织病理

16、和各种生物特性观察予以确定。研究发现,不同肿瘤移植接种成功率不同,肾母细胞瘤接种成功率为33%左右2。接种成功率决定于每个肿瘤自身的特性、肿瘤的类型、来源(原发肿瘤、复发肿瘤、转移瘤、标本处理方法、组织分化,以及裸鼠的周龄、营养状况、感染情况、接种部位都将影响接种结果。裸鼠前胸外侧壁较后侧肢体成功率高。裸鼠虽无T 淋巴细胞,但仍有免疫球蛋白、自然杀伤细胞、吞噬细胞,随裸鼠成熟或在感染情况下,这类免疫功能将成熟或被激活,使接种成功率降低。有报道用免疫抑制剂Carragheenan 抑制吞噬细胞功能或使用3周内的幼鼠可增加接种成功率。许多学者发现肿瘤的恶性程度与接种成功率有关,预后差的肿瘤、复发肿

17、瘤及尸检标本接种成功率高,肿瘤病理分化程度差接种成功率高。本课题接种的标本正是1例低分化间变型肾母细胞瘤,肿瘤为4期,临床见肿瘤已侵及肾静脉,预后较差。我们建立的肿瘤模型现已稳定传至第4代,平均成瘤率超过40%,第1代达100%,以后各代稳定在40%。本模型荷瘤鼠的潜伏期及倍增时间在各代之间表现较均一,潜伏期在4560d 左右,平均50d 。移植肿瘤在裸鼠体内一般要经过潜伏期后才开始生长,接种早期肿瘤细胞大部分坏死吸收,以后随肿瘤血管生成,受体的基质及血管长入,残留的肿瘤细胞增生,出现可见的肿块。这一时期一般为2周至3个月,不同肿瘤的移植瘤潜伏期并不一致,潜伏期可随传代过程而有所缩短,但肿瘤的

18、生长特点却在个代之间保持稳定。研究未发现肿瘤的恶性程度与潜伏期的关系。肿瘤的细胞动力学研究由来已久,早在1956年Collins 5在研究肺转移癌时提出了肿瘤的指数增长模型,1964年Laird 6进一步指出肿瘤的生长符合G ompertz 函数。肿瘤生长早期阶段接近指数形式,以后随代谢产物堆积、营养障碍、细胞死亡及有丝分裂周期延长生长速度逐渐减慢,最后接近平台期。本实验移植瘤符合这一生长规律。第2代长期饲养的荷瘤鼠平均生存中位数为223d ,最长荷瘤时间261d ,肿瘤未发现重要脏器转移,镜检可见肿瘤包膜。裸鼠主要死于肿瘤消耗和衰竭。本实验病理检查示各代转移瘤与原人体肿瘤之间镜下结构相同。典

19、型的肾母细胞瘤镜检可见小球样结构,本例肿瘤分化程度低,以胚基细胞为主,光镜表现不典型。电镜检查发现该肿瘤主要由未分化细胞组成,细胞核密集、核大、不规则、核仁多、贴边、包浆少。Vimentin 检测在各代细胞中均有明显表达,肾母细胞瘤移植模型中基质细胞Vimentin 可呈弱阳性7。图像分析仪DNA 检测结果示,肿瘤细胞主要为高倍体,在高二倍体到高四倍体之间,多数学者认为移植瘤DNA 指数较为稳定,近年来有肿瘤移植后DNA 指数改变的报道,K opf 2Maier 等8应用流式细胞仪研究发现移植瘤在接种早期细胞分裂相少见,进入指数增长期后分裂相细胞数量增加,当肿瘤超过10cm 进入平台期时分裂相

20、细胞再次减少,接种后肿瘤细胞染色质数量均有上述变化过程。肾母细胞瘤分子生物学研究主要集中于WT1基因异常与肾母细胞瘤的关系。80年代LOH 研究发现11p13位点可能存在抑癌基因,据此1990年克隆到了WT1基因,研究发现30%的无虹膜综合征、S 2B 综合征的肾母细胞瘤患者和10%的散发患者存在这一抑癌基因的缺失或突变。故该基因被认为与肿瘤的发生有密切的关系9。在裸鼠传代过程中,可发生染色体丢失造成所在部位的基因缺损,改变肿瘤细胞表型。笔者运用PCR 方法检测3端短重复序列发现其在各代之中均存在,说明该肿瘤无WT1基因所在部位的染色体丢失。但仍不能排除WT1基因存在点突变或外源序列插入的可能

21、,可进一步运用PCR 2SSCP 或DNA 测序方法明确。人肿瘤异体移植裸小鼠模型可模拟人癌体内的自然生长过程,已广泛应用于人类肿瘤的基础理论和临床治疗的实验。笔者建立的这一肾母细胞瘤异体移植瘤模型可用于肾母细胞瘤化疗、基因治疗、药物诱导治疗等各方面,为该肿瘤的进一步深入研究提供了一个较为理想的模型。参考文献1Sharkey FE ,Fogh J.Considerations in the use of nude mice for can 2cer research.Cancer and Metastasis Reviews ,1984,3:3412360.2Mattern J ,Bak M

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