微生物实验论文

1、摘要取适量的土壤样品进行蒸馏水溶解、富集培养、刚果红纤维素培养基筛选等操作后，分离出能够分解纤维素的细菌和真菌，对这些菌进行纯培养，观察其菌落颜色、形态等特征，并对所得菌用革兰氏染色法染色。实验后期分别通过甲基红试验、淀粉水解实验、pH梯度试验等生理生化反应，检测所得纤维素分解菌在分解过程中是否产酸、能否水解淀粉，以及不同pH值下分解纤维素的能力，为日后进一步的研究打下基础。关键词 土壤 纤维素分解菌 分离筛选pH试验Isolation and Screening of Soil Cellulose-Decomposing MicrobesZhou Yudi, Zhu Liang, Zhu X

2、iaoyu, Zong LuSchool of Life Science, Shandong University, Jinan,250100Corresponding author zhuliang0532AbstractIn our experiment, we took an appropriate amount of soil sample, dissolved them in distilled water, put them in enrichment culture, and then sifted the bacteria and fungus which can break

3、down cellulose by Congo red-cellulose medium. After that, we did the pure cultures to observe the color, shape and some other characteristics of the colonies, moreover, we stained the bacteria we got with Gram stain. Later we did some physiological and biochemical experiments such as methyl red test

4、, amyl hydrolysis experiment and pH gradient test to see whether these bacteria can produce acid, whether they can hydrolyze starch and their ability of breaking down cellulose under different PH valves. We hope that by doing this experiment, we can lay the foundation for further research in the fut

5、ure.Keywords Soil, Cellulose-decomposing microbes, Isolation and screening, PH experiment前言在工业化水平日益提高、科学技术飞速发展的今天，我们同时也面临着世界人口激增、矿产资源枯竭等严峻的问题。保护环境资源，寻找可利用的新型能源已成为科学工作者的新课题。对于人类来说，生物质资源是宝贵的可再生资源，是我们赖以生存的基本物质资源。据统计，地球上每年光合作用的产物中，90%以上为木质纤维素类物质。因此，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，将生产生活中产生的工农业废弃物转化为可利用的新能源，将具有极其

6、重要的意义和广阔的前景。土壤中的某些微生物有分解纤维素的能力。地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%60%能被这些微生物分解利用。微生物分解纤维素主要是因为它们能够分解纤维素酶。本次试验就是的目的就是从土壤中将这些能够分解纤维素的细菌分离出来，并对它们的形态特征、生理生化等进行研究和探讨。1. 土壤中纤维素分解菌的分离及筛选1.1 土样的采集土壤中的微生物，大约70%-90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约38cm的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集

7、较多的分解纤维素的微生物。综合各种因素，本小组分别从生科院南楼后的花园中和学生公寓4号楼下的落叶堆下取土壤样品。1.2 分离与筛选1.2.1 土壤悬液的制备称取土样5 g，迅速倒人带玻璃珠的45 mL无菌水瓶中，振荡20 min，使土样充分打散，即成为土壤悬液。1.2.2 富集培养在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。富集培养所需要的仪器有：250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。选择培养基的制备比例见下：纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉 5gNaNO31gNa2HPO47H2O

8、 0.5gKH2PO40.9gMgSO47H2O 0.5gKCl 0.5g酵母膏 0.5g水解酪素 0.5g将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml按上表比例配制50ml选择培养基。在250ml锥形瓶中装入50ml培养基，放56颗玻璃珠，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层牛皮纸，用线绳扎紧，在121下高压蒸汽灭菌20min。用移液器移取10mL土壤悬液于选择培养基中，将瓶置于摇床上，在30下振荡培养34d，至培养基变浑浊。1.2.3 梯度稀释所需仪器：试管（8支）、移液器、枪头。需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、枪头（黄色、蓝色）。用量程为1000L

9、的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-4, 10-5,10-6,10-7不同稀释度的土壤溶液。1.2.4 刚果红染色法分离所需仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头、温箱等。 需要灭菌的仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头。(1) 鉴别培养基的制备培养基成分如下：纤维素刚果红培养基（NH4）2SO4 2.0gMgSO47H2O 0.5g（或MgSO4 0.25g）KH2PO40.5gNaCl

10、0.1g纤维素 2.0g刚果红 0.4g琼脂 20g水 1000mLpH 7.0（2）涂布平板释倍数分别为105、106、107的样品溶液涂布到纤维素刚果红培养基上，37培养34 d（3）菌落形态观察选取一株生长较好的白色菌株（菌1）和一株粉红色菌株（菌2）和一株水解圈非常明显的菌株（菌3）和一株黄色真菌（菌4）进行划线分离。（4）划线分离将步骤(1)中的鉴别培养基加热熔化后倒入4个无菌平皿中，凝固后，用接种环挑取(3)中4种菌落在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养，至长出单菌落。2. 革兰氏染色及菌种保存1. 革兰氏染色基本原理：革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学

11、家Christain Gram氏创立的，而后一些学者在此础上作了某些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色的主要原理是由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别，染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物

12、结合程度底，吸附染料差，易脱色，这是染色反应的主要依据。另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同PH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；PH很低时，则可都呈负反应。此外，两类菌的细胞壁等对结晶紫碘复合物的通透性也不一致，阳性菌透性小，故不易被脱色，阴性菌透性大，易脱色。所以脱色时间，脱色方法也应严格控制。所需仪器或试剂：菌种1，2的平板培养物、革兰氏染色液（结晶紫碘液，番红染液）、显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、蒸馏水等。操作步

13、骤：制片（涂布、干燥、固定）结晶紫初染12min，水洗碘液媒染1min，水洗乙醇脱色30s，水洗番红复染1min，水洗干燥镜检，油镜观察。镜检结果见表1和图1、2、3、4。表1 革兰氏染色结果（“+”表示阳性，“”表示阴性）阴性/阳性白色菌（菌1）粉色菌（菌2）+水解圈菌（菌3）黄色菌（菌4）+图1 黄色菌（菌4）图2白色菌（菌1）图3 粉色菌（菌2）图4 水解圈菌（菌3）2. 菌种保存斜面（CMC培养基：NaCl 6.0g，MgSO47H2O 0.1g、KH2PO4 0.5g、CaCl20.1g、K2HO4 2.0g、CMC15g、（NH4）2SO4 2.0g、pH7.07.4、水1000m

14、L。配好后，灭菌 121，20min）马铃薯培养基（马铃薯20g、蔗糖 2g、自来水 100mL、琼脂 2g、pH 自然（约6.0）、灭菌 121，20min）将分离得到的3种菌白色菌株（菌1）、粉红色菌株（菌2）、水解圈非常明显的菌株（菌3）分别接种在六个试管中CMC斜面上，用于菌种保存和生理生化试验。黄色真菌（菌4）接种在马铃薯培养基斜面上。3. 生理生化鉴别反应3.1 淀粉水解实验3.1.1方法（1）培养基成分：蛋白胨1g , NaCl 0.5g，牛肉膏0.5g，可溶性淀粉0.2g，琼脂1.52.0g，蒸馏水100mL，高压蒸汽灭菌锅内121灭菌20min.（2）灭菌后,将试剂瓶取出,冷

15、却至50左右，无菌操作制成平板。用记号笔在平板底部划成4部分，将黄色菌、白色菌、粉色菌和x菌（在刚果红培养基上出现透明圈的菌）分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别在4部分写上菌名，将平板倒置在30温箱中培养3天。（3）将所有的培养物放入37中培养48h后取出，观察各种菌的生长情况。关产淀粉培养物中菌长的程度，打开平板盖子，滴入少量碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。观察菌苔周围有无出现无色透明圈以及透明圈的大小。3.1.2结果见图5，表2图5 淀粉水解实验结果表2淀粉水解实验结果（“+”表示阳性，“”表示阴性）项目水解结果黄色菌（菌4）+白色菌（菌1）+粉色菌（菌2）水解

16、圈菌（菌3）+结果分析：其中，加入碘液后不久，黄色菌和x菌就出现明显的水解圈，不久，白色菌也出现水解圈。水解圈大小为：黄色菌 x菌白色菌3.2 甲基红实验3.2.1方法（1）培养基成分：蛋白胨1.25g，葡萄糖1.25g，K2HPO40.5g,量取蒸馏水250mL，放入烧杯中，加热搅拌并溶解，调整pH为7.07.2，分装试管，每管10mL，112灭菌30min（2）灭菌后，取出培养液，冷却后将大肠杆菌和产气肠杆菌以无菌操作接种于培养基中，放入30恒温箱中培养3天。(3)将1支葡萄糖蛋白胨水溶液培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色这为阳性，变为黄色的为阴性。注意：甲基红试剂不能加的太

17、多，否则会有假阳性出现。3.2.2结果图6 甲基红实验结果表3甲基红实验结果（“+”表示阳性，“”表示阴性）名称 结果黄色菌（菌4）白色菌（菌1）粉色菌（菌2）+水解圈菌（菌3）+结果分析：见图6，表3滴入甲基红试剂后，培养黄色菌和白色菌的培养液变为黄色，而培养粉色菌和x菌的培养液成为红色，这说明了四种细菌在培养的早期均产生有机酸，但粉色菌和x菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而黄色菌和白色菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。因此，粉色菌和x菌为阳性，黄色菌和白色菌为阴性。3.3不同pH对菌生长的影响3.3.1方法（1）培养基成分：无机盐营养液1000mL（KH2

18、PO42g、MnSO4 1.6mg、ZnCl2 1.7mg、CoCl2 2.0mg、（NH4）2SO41.4g、MgSO47H2O 0.3g、CaCl20.3g、FeSO4 5mg、水1000mL，pH 5.5）于直径为1.5cm、长15cm的试管中加入上述无机盐培养基5mL，加入一条去淀粉处理的滤纸（6cm1cm）垂直于试管中，用酸和碱调整它们的pH值，使之pH分别约为4，5，6，7，8，9，10，并做好标记。放入高压蒸汽灭菌锅内112灭菌30min。（2）灭菌后，在无菌条件下，将黄色菌接种于其中，再放入30恒温箱中培养3天。3.3.2结果在以滤纸条为唯一碳源情况下，不同pH值对黄色菌分解纤

19、维素的酶有较大影响，pH为6的试管中滤纸的絮状沉淀最多，其次为pH为5，7，8，4.当pH为9和10时几乎看不到絮状沉淀，说明黄色菌在此条件下纤维素分解酶活性最低。总体，黄色菌在不同pH条件下纤维素分解酶活性大小为pH6pH5pH7pH8pH4。其中pH9和pH10时，其酶已经基本失活。见图7。图7 从左至右pH分别为4，5，6，7，8，9，104. 结果与分析4.1结果在菌种筛选中，取土壤悬液于富集培养基中，将其置于摇床上富集培养了三天，一开始由于稀释倍数太小导致初筛得到的菌落长势不好，菌落又小又密。于是，我们重新做了稀释，最终选择稀释了105，106，107 倍等稀释倍数较大的富集液用涂布器涂布在纤维素刚果红平板培养基上，培养了三天后观察到较明显的四种菌落，粉红色菌落，黄色菌落，白色菌落和产生有水解圈的X菌。将它们再次接种到纤维素刚果红培养基上进行复筛培养。之后接种到土豆培养基上进行纯培养。最后进行鉴定和做生理生化实验。刚果红纤维素培养基作为筛选菌种的培养基，可以很快识别出菌种讲解纤维素能力的高低，大大方便了筛选得到较纯菌种的工作。但是染料浓度的高低、每个培养皿中培养基的多少常常会导致培养基本身的背景值大小有所差异，因此限制了观察的效果。不同菌株对纤维素类物质的分解能力不一样。在同一个培养