综述溶菌酶的制备及其性质

1、综述 溶菌酶的制备及其性质Abstract：Lysozyme is a kind of glucoside hydrolytic enzyme ， and its molecular weight is about 1400015000DaLysozyme can hydrolyze the glucoside bond -1，4 betwee n N-acetyl muramic acid，so that it can dissolve the cell wail of gram-positive bacteria and bacteriolyze It can be applied in

2、many areas ， for example ， in food and drink fields as antiseptic substance and in medical domain as germicide.【实验要求】 ： 通过探索和学习相关内容的理论和技术，熟悉并进一步掌握酶的提取，分离，纯化，检 测溶菌酶的生物学性质和理化性质。【实验原理】 :溶菌酶：是一种有效的抗菌剂，又称胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的 N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰氨基葡糖之间的 -1,4 糖苷键，使细胞壁 不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽， 导致细胞壁破裂内容物逸出而使细

3、菌溶解。 溶菌酶还可与 带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。来源：自然界中，溶菌酶普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的鼻涕、唾液、眼 泪、尿、血浆、乳汁、淋巴液及鼻黏膜、肠道、腮腺、白细胞、肺、肝、脾、肾的细胞中， 以及植物界中的卷心菜、萝卜、无花果、术瓜、大麦中，但以蛋清中含量最丰富。理化性质：分子量 14700；溶于水，不溶于乙醚和丙酮，等电点为 10.8 ，最适 pH值 6.5 。 最适温度 50；稳定性：酸性介质中可稳定存在， 碱性介质中易失活； 280nm的消光系数为 13.0 。酶活性可被该酶活性

4、可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-510-3M）以及 N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被 Mg2+,Ca2+（10-5 10-3M）、NaCl所激活。提取原料： 鸡蛋（含量约为 2%到 4%）。鸡蛋清按水分和固形物所占比重，则含水分 87%，固形物 13%；固形物中大约 90%是蛋白质，其中：卵白蛋白 75%，卵类粘蛋白 15%，卵 粘蛋白 7%，伴白蛋白 3%。卵白蛋白分子量 45000，pl4.7 ；卵类粘蛋白鸡卵粘蛋白分子量 28000， pl3.9-4.5 ；伴白蛋白分子量 77000，pl3.9 。实验方法：a 热变性法：溶菌酶在酸性条件下耐热性好，耐热89C以上， 10

5、0C加热仍然保持活性，而杂蛋白卵蛋白等变性温度低。可用热变性法来去除杂蛋白。b 等电点沉淀法：蛋清中其他蛋白等电点较低，为 3到 5左右（见上一步蛋清成分 分析），溶菌酶 pl 为 10.8 ，可用调 pH来去除卵蛋白，来提高溶菌酶浓度。c D152 树脂柱层析法： 离子交换树脂法提纯溶菌酶是根据溶菌酶和离子交换树脂的 基团之间进行交换的， 由于溶菌酶是一种碱性蛋白质， 可采用阳离子交换树脂。 离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律。树脂对离子亲合 力的大小，与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关。经实验证明，在 低浓度、常温下，离子交换树脂对不同离子的亲合力顺序有下列规律。

6、对于在 弱酸性阳离子交换树脂中具有相同价态离子的亲合力顺序为：Ag+ Cs+ Rb+ K+NH4+Na+H+Li+。根据弱酸性阳离子交换树脂的亲和力顺序， 相同条 件下弱酸性阳离子交换树脂对 H+的亲和力比对 Na+的亲和力要大， 可采用 D152， D201， D903型大孔树脂进行交换。蛋白质中溶菌酶含量一定，由于树脂对H+的亲和力比对 Na+的亲和力要大，而使得溶菌酶与 Na 型树脂交换得更彻底，故 本实验采用 Na 型树脂。d Sephadex- G-50 分子筛柱层析： 葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝 胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而

7、在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全 被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间 流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的 网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。Sephadex- G-50 为每克凝胶膨胀时吸水 5.0 克， SephadexG-50 葡聚糖凝胶 G-50 分离范围 1500-30000 适用于多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定。e SDS-PAGE： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷 以及分子的大小 和形状等因素， 通过迁移率不同经过跑柱和

8、染色后可以得到不 同蛋白质的分离带，来鉴定蛋白质的种类。本实验用来验证只有一条带（溶菌 酶），来鉴定纯度（可能只有溶菌酶）。f Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量： 此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是 加入了第二种试剂，即 Folin 酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白 质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中 的肽键与铜结合生成复合物。 Folin 酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白 质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在 一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。g 微球菌和溶菌酶作用测定酶活力： 由于溶菌酶能水解溶壁微球

9、菌，使得底物悬浮 液的浊度（可用 450nm波长下的吸光度来衡量）下降，故可用反应液在450nm波长下吸光度下降的速度来表示酶活性。h. 超滤法提纯蛋清溶菌酶： 超滤法是利用膜两侧的压力差，使小分子透过膜，而大 分子物质留在膜内不透过，从而实现对酶的浓缩精制。超滤法的优点有不易引起酶 变性失活，而且操作比较方便，因而近年米在酶制剂生产中得到了研究和应用。但 存在膜容易堵塞，操作时间长等缺点。本文通过对超滤法提纯蛋清溶菌酶的研究， 对提纯到的酶的收率和活性与酸性条件下热处理法、离子交换树脂法进行比较。i.【实验步骤简述（具体操作流程见书）】：鸡蛋清的制备 （pH=8） 鸡蛋清粗提取（去除较大的杂

10、质）D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析（洗脱杂蛋白，根据分子量以及酸碱性）Sephadex-G-50 分子筛柱层析（根据分子量大小进一步进行提纯溶菌酶） 溶菌酶活力测定（根据产物在 450nm处特定吸收光密度下降来测定活力） 蛋白质分子量测定（福林酚法） 蛋白质纯度测定（ SDS-PAGE显示一条带来表示 纯度很高） 理化常数和激活抑制剂的测定【实验方法讨论】 ：1. 溶菌酶的提纯方法：由于我国的溶菌酶生产存在收率低、 活性低等缺点， 所以目前溶菌酶的市场人部分依赖 进口。 本研究通过对热处理法、 离子交换树脂法和超滤法提纯溶菌酶效果的研究， 目的就是 寻找一种操作简单、 成本较低、 适合产

11、业化生产的方法， 井尽可能提高溶菌酶的活性和收率， 满足国内市场的需求。2. 酸性条件下热处理法提纯溶菌酶： 在酸性条件下溶菌酶具有热稳定性，不易变性失活，且溶菌酶和卵蛋白的等电点分别为11.0 和4.5 ，由于溶菌酶和卵蛋白的性质著异，因而在接下来的实验中采用热变性和调pH值使卵蛋白沉淀的方法来探讨去除卵蛋白的较好方法。 研究发现溶菌酶和卵蛋白之间存在静电 作用力， 在加热以及调等电点来除卵蛋白的时候溶菌酶会随卵蛋白一起沉淀。 加入磷酸盐缓 冲液后经热处理和调 pH值到卵蛋自等电点， 沉淀中不再含有溶菌酶， 实验证明加入磷酸盐缓 冲液可以去除溶菌酶和卵蛋向之间的静电作用力。 研究得出去除卵蛋

12、白效果最好的时候是在 pH=7.5 的磷酸盐缓冲液的条件下， 100C下热处理 2min，上清中溶菌酶纯度可达到 67.17%， 远高于其它条件的磷酸盐缓冲液以及碳酸氢钠缓冲液条件下的处理效果。 该方法虽然简单成 本低但是也造成蛋清余液无法重复利用，加人了实际生产成本。3. 离子交换法提纯溶菌酶 离子交换树脂法提纯溶菌酶是根据溶菌酶和离子交换树脂的基团之间的离子交换而进行 的，由于溶菌酶是一种碱性蛋白质， 常采用刚离子交换树脂。 本实验选用了一种弱酸性阳离 子交换树脂进行溶菌酶的提取， 并探索了不同条件对溶菌酶活性及收率的影响。 溶菌酶的提纯纯度、 收率和活性除了受到离子交换树脂类型的影响外，

13、 值、提纯温度、均质条件、稀释倍数等也对其影响很大。洗脱液的类型和浓度、蛋清的 pH通过对离子交换法提纯溶菌酶的纯度和活性研究表明，温度对溶菌酶纯化有一定影响，随着温度的升高， 酶和树脂的吸收速率也随之加快： 而蛋清液的 pH值对提取到的溶菌酶活性和收率的影响是最大的， 这是因为溶菌酶是碱性蛋白质，在偏酸性条件下比较稳定，碱性条下容易出现分解； 蛋清得稀释倍数和均质条件对溶菌酶纯化也有一定影响， 但稀释倍数超过4倍的时候树脂与溶菌酶的专一性吸附受到破坏，洗脱液中含有大量的卵蛋白，这是因为为 稀释造成了溶菌酶和树脂之间的专一性吸附受到影响的原因， 而均质则是通过破坏溶菌酶的 物理结构破坏其活性。

14、实验得到的溶菌酶的收率、纯度和活性都很理想，同时由于离子交换法原料来源简单、 易丁再生、 操作时间短、 易于一体化生产而且吸附后的蛋清能再利用的特点，成为大批量 生产溶菌酶的理想方法。4超滤法提纯溶菌酶超滤法是利用膜两侧的压力差， 使小分子透过膜， 而大分子物质留在膜内不能透过， 从 而实现对酶的浓缩精制。 超滤法的优点有不易引起酶变性失活 而且操作比较方便。 溶菌酶 分子量 14000-15000Da ，相对卵清蛋白分子量 45000Da是一类分子量较小的物质。 因此本实验 用截留量的膜提取溶菌酶获得了较好的效果，但是超滤法在实际操作过程中超滤时间过长， 超滤膜易堵塞， 这限制了它进行溶菌酶

15、工业化生产的利用。 因此， 有必要对超滤条件进一步 进行研究。5. 溶菌酶的磁性亲和分离 很多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地特异结合的特性 （分子间通过某 些次级键结合， 如范德华力， 疏水力，氢键等， 在一定条件下又可解离） 。如：酶和底物（包 括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合，特异性的抗体一抗原（包括病毒、 细胞）、激素与其受体、载体蛋白的结合，基因与其互补DNA、 mRN及A 阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。 均属于专一性而可逆的结合， 这种分子 之间的结合能力叫做亲和力。 亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的

16、层 析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。它具有分离快速，纯化 效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了 独特的优越性。 因此， 亲和层析技术已成为纯化生物分子， 特别是纯化生物活性物质最重要 的方法之一。 磁性介质被广泛用于分离细胞、 核酸蛋白质等生物大分子和激素等小分子生物 活性物质，其优点在于通过外磁场的作用可快速地实现固液及磁性介质与其它固形物间的分 离，尤其是当待分离的液体样品含有其它固形物或粘度较大时。 磁性亲和分离技术是将亲和 吸附的专一性、高效性与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新型分离技术。6. 酶纯度的测定分析蛋

17、白质纯度鉴定通常采用物理化学方法， 如：电泳、 HPLC等。其中常用的电泳分析方法 有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE）、等电聚焦、聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE）等。纯 的蛋白质在一系列条件下进行电泳时， 都将以单一的速度泳动， 它的非变性电泳图谱应只呈 现一条染色带。 HPLC常用于多肽、 蛋白质纯度鉴定， 纯的蛋白样品在洗脱图谱上呈现出单一 的对称峰。电泳结果分析：1. 根据电泳图谱分析溶菌酶的纯化情况。2. 根据标准蛋白的分子量和迁移率及目的蛋白的迁移率， 计算目的蛋白的分子量 （以 lgM 对迁移率 R作图，其中 M为蛋白质分子量）。7. 酶活力的测定酶活力的测定采取溶

18、菌酶能水解溶壁微球菌， 使得底物悬浮液的浊度 （可用 450nm 波长下的吸光度来衡量） 下降， 故可用反应液在 450nm波长下吸光度下降的速度来表示酶活 性的经典方法。然后计算酶活力的单位：酶的活力单位数 =A450nm/t 0.001比活力 =酶的活力单位数 /mg 蛋白质8. 酶含量的测定除福林酚法外，又一方法：蛋白含量的测定用考马斯亮蓝 G-250 法分析溶液中可溶性蛋白的含量。取 50uL 的样品 液加进 2.5mL的考马斯亮蓝 G-250溶液，摇匀，放置 5min后，在 595nm波长下测定吸光度， 并根据标准曲线计算出蛋白含量。 （由标准曲线求得的回回方程为：酶样蛋白含量： b（mg/mL）=1.674 A595nm-0.0354 ）【影响因素】 ：1. 对酸性条件下通过热变性利等电点变性的方法去除卵蛋白提取溶菌酶的效果研究发 现溶菌酶和卵蛋白之间存在相互结合作用， 在加热以及调等