肿瘤免疫细胞治疗平台及CAR-T技术的建立临床重点项目计划书

1、临床学科重点项目计划书项目名称：肿瘤免疫细胞治疗平台及CAR-T技术的建立资助金额：万元科室（单位）：血液科项目负责人：项目负责人联系电话：项目负责人手机：项目负责人电子信箱：执行年限：年1月1日年12月31日项目组人员情况厅P姓名职称出生日期学位1主任医师博士2教授/主任医师博士3研究员博士4主治医师硕士5助理研究员博士6助理研究员博士7助理研究员硕士8主治医师学士9主治医师博士10主治医师硕士11主治医师硕士12主治医师学士13主任医师学士14主治医师博士15助理研究员博士16主治医师博士17住院医师博士项目简介近年来淋巴瘤的发病率逐年上升，已超过所有血液恶性月中瘤的总和，占恶性 血液病之

2、首。淋巴瘤已成为一个威胁国民健康的重要病种，具类型较多、异质性较强，侵袭性亦不同。随着化疗体系的完善和靶向新药的应用， 淋巴瘤的疗效显 著提高，已达到60%以上，但其中有部分患者仍会耐药或复发，成为目前治疗 的难点和重点。免疫细胞治疗是月中瘤生物治疗中重要的发展方向。自体免疫细胞治疗技术是指从自体外周血中分离的单个核细胞经过体外激活和扩增，达到一定数量后回输 患者体内，以发挥其直接杀伤月中瘤细胞和病毒感染细胞的作用，调节机体免疫功能的作用。嵌合抗原受体修饰 T细胞(Chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T) 技术是一种革命性的治疗血液系统恶性月中瘤的免疫细

3、胞治疗方法，该技术将抗体 对月中瘤抗原的高亲和性与 T淋巴细胞的杀伤功能相结合，使其具有特异性识别 并杀伤月中瘤细胞的能力。CAR-T细胞技术已成功应用于难治复发白血病的治疗， 美国的临床研究显示对很大一部分B淋巴细胞复发难治的白血病患者可以起到很好的疗效，是月中瘤治疗领域的革命，本研究组也在2例难治复发B细胞淋巴瘤患者中应用了 CAR-T治疗，取得了较好疗效。该治疗策略临床风险较小， 对患者疗效较好，可延长患者无病生存时间、降低患者复发率，明显改善患者的 生活质量。与传统的化疗比较，该疗法对患者毒副作用小，患者易于接受。近年国际血液、月中瘤界免疫治疗相关研究非常活跃，但CAR-T技术仍在探索

4、中，国际仅部分月中瘤中心在进行临床试验， 尚未普遍开展，我国在这方面刚刚 起步，且在淋巴瘤治疗中尚未见报道。如果我们能够抓住这一契机，开展CAR-T 治疗，将可明显改善难治、复发淋巴瘤患者的治疗效果，使更多的患者从中受益， 并可使我院的淋巴瘤免疫治疗居国内领先地位，提高医院及科室声誉和经济效 益。报告正文三、立项依据目前淋巴瘤的发病率在所有恶性血液病中居首位，近年来我国淋巴瘤的发病 率也逐年上升。由于淋巴瘤现在已成为可以治愈的月中瘤，60%以上患者经规范化治 疗可长期生存，但本病类型较多、异质性较强，侵袭性亦不同，难治、复发疾病 的治疗仍是临床医师面临的难题：针对其不同分类、分期及预后因素，探

5、索新的、 规范化的诊疗方案对患者具有重要意义。与发达国家比较，我国 T细胞淋巴瘤、 高恶性淋巴瘤、侵袭性淋巴瘤及结外非霍奇金淋巴瘤的发病率高，因此我国淋巴 瘤预后不良的亚型较多，临床表现为难治性及侵袭性临床过程，预后较差。常规 化疗近期疗效尚可，但远期生存率低，预后不良，需进一步研究患者的预后相关 因素，并探索新的治疗策略。免疫细胞治疗因其是只针对月中瘤细胞进行的特异性治疗，对正常组织损伤较 小，逐渐成为一种全新的有希望的治疗模式。目前针对淋巴瘤的免疫治疗有了很 多进展和突破，近几十年人们一直尝试采用免疫学方法治疗月中瘤，如输注异基因 淋巴细胞(donor lymphocyte infusio

6、n, DLI)及输注树突状细胞(Dentritic cell)疫 苗。树突状细胞疫苗用于月中瘤免疫治疗包括如肽、蛋白、月中瘤细胞及提取物的体 外致敏，月中瘤相关抗原(TAA)、RNA或细胞因子的基因转移，与月中瘤细胞形成 融合细胞等。目前，细胞免疫治疗己经成为月中瘤生物治疗中重要的发展方向，包 括淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)、浸润月中瘤淋巴细胞(TIL)、CD3单抗激活的杀伤 细胞(CD3AK)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer ,CIK)等。同时针 对乙肝病毒、EBV的免疫细胞治疗也在临床取得了一定疗效。嵌合抗原受体修饰 T细胞(chimeric an

7、tigen receptor T cell, CAR-T)是近年来受 体迅速发展的月中瘤过继免疫治疗新手段，是将识别月中瘤相关抗原的单链抗体(scFv) 和T细胞受体TCR复合体的CD3七胞内激活结构域结合为一体，即将抗体对月中瘤 抗原的高亲和性与T淋巴细胞的杀伤功能相结合，使其具有特异性识别并杀伤月中 瘤细胞的能力，同时也可以刺激体内 T细胞增殖。CAR-T技术自提出后至目前共 有3代，第1代CAR-T不包括修饰因素，治疗效果不太理想，之后的学者在细胞的胞内区增加了 1-2个共刺激信号结构域，根据修饰分子的多少及类型分为第2代和第3代CAR-T,第一个共刺激信号为CD28或4-1BB,第2个

8、共刺激信号可能 有：CD27, CD28, 4-1BB, ICOS或OX40等。自体T细胞可以通过基因修饰后逆 转录病毒或慢病毒载体转导技术来长期表达 CARs,因此CAR-T治疗可能实现对 疾病的长期控制，患者体内可在几年内均检测到CAR-T细胞，但是，靶向治疗的毒副反应及转染的风险还需得到进一步关注。如同任何基因表达治疗方法，CART表达框架在人体染色体基因组的随机插入，仍存在着对重要功能基因的不确定影 响（如增强、阻断、突变、癌变等），故其潜在的临床应用安全性和副作用仍然 是阻碍这一方法未来广泛普及的障碍。表达框架的安全精确定点插入，是解决这 一问题的关键。2011年美国Dr. June

9、研究小组在新英格兰医学杂志上发表了应用 CART 细胞成功治疗慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL ）的临床研 究报告，这项工作中他们尝试治疗了 3例复发难治的成年白血病患者，其中2例 完全缓解并保持至今。2013年12月，美国血液学年会新闻发布会报道全美共治 疗了 59例复发难治白血病患者，其中 24名获得了完全缓解。2014年10月， Dr. June报告了最新治疗的30例复发难治白血病患者中有 27例达到完全缓解， 完全缓解率达90%。CART技术独特的作用机制和惊人的治疗效果使人们切实地 领悟到基因工程修饰的T细胞方法一CAR-T细胞治

10、疗方法，将成为未来免疫细胞 治疗诸多方法中威力最强、前景最好的方法，是月中瘤治疗领域的一次革命。血液 科在医院的大力支持下，较早开展了血液月中瘤及部分实体瘤的细胞治疗，前期已 有成熟的DC+CIK细胞治疗经验，而且已经在 2例难治复发弥漫大B细胞淋巴瘤 患者中应用了 CAR-T治疗技术，患者均取得了较好疗效，并无较重毒副反应，也 显示该技术具有一定的临床推广应用前景。CAR-T细胞治疗的毒副反应主要来自成指数增殖的 T细胞，但这也是CAR-T 细胞发挥效应所必需的，因此还需平衡风险及收益。细胞因子释放综合征（CRS）是常见且最突出的毒副反应，是由细胞因子激增所致的炎症过程，包括流感样症 状、血

11、管渗漏和多器官功能衰竭所致的低血压等。研究表明，患者不论肿瘤负荷 高低均会出现程度不等的CRS表现，目前较高的月中瘤负荷是唯一明确的预测严重CRS的指标，较CRP而言，细胞因子水平可能是更好的标记物，但还需要更多的 临床数据来验证。目前我科已经开展了患者的免疫功能全套检测，可以对患者的 免疫细胞及细胞因子进行治疗前后的监测，在预防CRS中具有重要的临床意义。因此，本课题拟依托我院的临床干细胞中心，进行如下工作： 1、建立免疫细 胞治疗平台，规范血液科免疫细胞治疗流程；2、建立常规CIK、DC+CIK、EBV-CIK 等细胞治疗及细胞培养标准操作流程；3、新技术的探索：选择难治复发B细胞淋 巴瘤

12、患者，评估其一般情况及免疫功能，并对患者进行 CAR-T免疫细胞治疗，治 疗后监测其免疫功能，并对患者进行随访及评估，以期评价 CAR-T免疫细胞治疗 的有效性及安全性。四、项目的研究目标、研究内容、以及拟解决的关键问题（一）研究目标1. 建立细胞治疗平台，规范治疗流程2. 建立临床级CAR-T制备技术平台3. 新一代CAR-T技术的应用（二）研究内容1. 免疫细胞治疗技术1） 细胞毒性T淋巴细胞（CTL） +/-树突状细胞（DC）免疫细胞治疗：血细 胞分离机分离患者外周淋巴细胞 50-70ml,离心后在我院GMP实验室培 养CTL及DC细胞，分2-3次回输至患者体内。2） 过继性NK免疫细胞

13、治疗：血细胞分离机分离患者外周淋巴细胞 50-70ml, 离心后在我院GMP实验室培养NK细胞，分2-3次回输至患者体内。2. 建立标准化管理体系1） GMP实验室标准化操作流程的建立2） 完善细胞培养的SOP保证标准化生产3） 人员培训：临床医师及实验室工作人员的培训3. 质量控制1） 细胞数量、成分、活性的质量控制2） 微生物及病原体的控制4. 建立临床级CAR-T细胞制备技术平台1）筛选CD19+淋巴瘤患者2）进行10-20例CAR-T细胞治疗5. 进行CRISPR联合CAR-T技术的基础研究：常规 CAR-T方案基因插入具 有随意性，而应用CRISPR技术可以做到精确定点插入目的基因。

14、（三）拟解决的关键问题1、 选择难V台复发B细胞淋巴瘤患者，进行第三代 CAR-T免疫细胞治疗；2、 在CAR-T免疫细胞治疗前后检测患者各种免疫细胞及细胞因子，并评价 这些指标在预测细胞因子风暴（CRS）严重程度中的作用；3、 建立常规CTL、DC+CTL等细胞治疗及细胞培养标准操作流程；建立我院免疫细胞治疗平台，规范血液科免疫细胞治疗流程。五、拟采取的研究方案及可行性分析。研究方案本研究拟进行10-20例复发难治白血病病人的自体 19CART细胞治疗。患者签署 知情同意书，筛选合格后注册登记入组，采用细胞治疗联合化疗方法治疗。通过观察细 胞治疗后的副作用，评估19CART治疗方案的安全性；

15、与病人自身过去标准方案治疗的 结果比较，定期随访评估19CART治疗方案的有效性和可行性。（一）入选标准：1）符合以下条件的CD19阳性的白血病患者：符合以下条件的ALL患者：不适合异体干细胞移植条件或由于条件限制放弃异体干细胞移植的。符合以下条件的CLL患者：I先前至少经过2次化疗方案（不包括单药的利妥昔单抗）治疗的；II最后一次化疗与疾病进展间隔不足 1年的；III不适合异体干细胞移植条件或由于条件限制放弃移植异体干细胞移植的。2）年龄18-60岁；3）预计生存期3个月至2年；4）自体移植患者，无论其之前经过怎样的治疗，复发后都是符合条件的；5）育龄妇女在给药开始前尿妊娠试验阴性，并同意在

16、试验期间直至最后一次随访采取有效的避孕措施者；6）自愿参加本实验并签署知情同意书者。（二）排除标准：具备下述排除标准中任何一项的患者不能入选本试验：1）具有癫痫病史或其他中枢神经系统疾病者；2）具有移植物抗宿主反应，需要使用免疫抑制剂者；3）既往有QT期间延长或严重心脏疾病者；4）怀孕或哺乳期妇女（本疗法对未出生的孩子的安全性尚未知）；5）未治愈的有活动性感染者：6）活动性乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染者；7）参加治疗前2周内合并使用全身性类固醇药物者（最近或目前正在使用吸入类固 醇的除外）；8）之前使用过任何基因治疗产品者；9） T细胞被复制缺陷型慢病毒转导的效率低于 30%,或应答CD3 /

17、CD28共刺激信 号时扩增能力不足（5倍）者；10）肌酸酊2.5mg/dl或ALT / AST3倍正常量或胆红素2.0 mg/dl者；11）患有其他未被控制的疾病，研究者认为不适合加入者；12）艾滋病病毒感染者；13） CNS中枢神经系统受累的白血病患者；14）研究者认为可能增加受试者危险性或干扰试验结果的任何情况。（三）剔除标准：受试者符合以下任何一项标准的，将提前退出试验：1 .受试者要求退出试验；2 .严重违背方案；3 .发生不良事件，研究者判断需要终止试验的情况，包括：NCI CTC3级症状；细胞输注24周内的任何时间发生可能、很可能或确定与本研究有关的实验室毒性 和临床事件，包括但不

18、限于输注毒性和任何可能与19CART细胞有关的任何毒性，如发烧、皮疹、中性粒细胞减少，血小板减少，骨髓再生障碍性贫血，肝功能异常、肺浸 润或其他肺毒性等；4 .受试者怀孕；5 .从受试者采集的T细胞数量不足以制备满足标准的 19CART细胞的；6 .受试者新发继发恶性月中瘤。（四）治疗方案1 .细胞治疗前的化疗方案：化疗在细胞输注前-4-1天进行，以保障19CART细胞能够在化疗结束12天后 输注。化疗的目的是减少淋巴细胞数量，以促进 19CRAT细胞的移植和稳定的扩增。化疗也是为了减小肿瘤负荷。CART细胞治疗后发生细胞因子释放综合征（CRS）的概 率和严重程度与月中瘤细胞负荷呈正相关。化疗

19、药物可将月中瘤细胞数目降低，从而降低细 胞因子释放综合征发生的概率和严重程度。减瘤化疗是可选方案，不是本研究方案的必 须部分，可以根据月中瘤医生的建议做出选择。化疗的选择将取决于患者病情和既往的治 疗。根据美国临床研究报道的成熟方案设计化疗方案如下：输注前第4,3,2天：连续3天静脉注射福达华（fludarabine）,注射剂量为2530mg /m2/day;输注前第2天：同时静脉注射环磷酰胺（cyclophosphamide）,注射剂量为900mg /m2/day;2 .病人CART细胞回输方案：根据美国已有的文献报道，CAR修饰的T细胞回输量为1 x1051x107细胞/公斤 体重。本研究

20、参照此范围，并根据收集到的病人T细胞数量来酌情制定回输方案。输注剂量：1 x1051x107细胞/公斤体重 输注形式：采用分次输注。第一次输注过程分 3天进行。第0天按照输注剂量的10%将CART细胞经静脉缓 慢输注入病人体内，输注过程约持续30分钟。第1天按照输注剂量的30%,第2天 按照输注剂量的60%进行输注；输注后严密监控病人是否有临床并发病症， 对于有足够的19C ART细胞可用 且无 临床并发症的患者可于第11天酌情进行第二次静脉输注。3 .细胞因子释放综合征（CRS）应对策略根据美国临床试验的文献发现，由于 19CART细胞杀灭月中瘤细胞的效率非常 高， 大量的细胞因子会在短时间

21、内被释放到血液中，病人在19CART细胞回输后 的第714天可能发生细胞因子释放综合征（CRS）,即所谓的 细胞因子风暴19CART细 胞治疗后发生细胞因子风暴的概率和严重程度与月中瘤负荷正相关。细胞因子风暴的直接临床表现为发热。我们拟采用在美国同类临床研究中被证明有效的抗白介素-6R抗体Tociluzuma b （8mg /kg）来控制细胞因子释放综合征（CRS）,同时酌情结合糖皮 质类 激素来配合治疗。4 . B细胞耗竭的应对方案由于正常 B细胞也具有 CD19抗原，所以19CART细胞攻击 CD19阳性的月中瘤 细胞时会同时攻击 CD19阳性的正常B细胞，可能使B细胞耗竭而发生低丙 球蛋

22、白 血症。对于低丙球蛋白血症的案例，在临床上受试者按照临床剂量准则给予静脉免疫球 蛋白（IVIG）治疗，以恢复正常血清免疫球蛋白水平。5 .不受控制的T细胞扩增应对方案19CART细胞的扩增可能不受正常的体内正常的平衡机制控制。美国临床前研究表明，19CART细胞的增殖只对生理信号或针对 CD19有反应。本研究中T细胞可能 对月中瘤细胞或正常 B细胞产生的信号有反应而增殖。这可能是有益的也可能是有害的，取决于T细胞增殖的程度。以往的试验表明，T细胞克隆数占 主导地位与月中瘤细 胞的减少有关。如果受试者发生T细胞过度增殖的情况，可以使用糖皮质激素予以干 预。（五）观察项目与时点、试验流程1 .安

23、全性观察项目根据国家卫生部药政局制定的新药临床及临床前研究指导原则中的毒性分级标 准和可能出现的副作用进行各项指标的记录：、体格检查；、一般情况：心率、心律、呼吸、血压、体温；、实验室检查：血常规、尿常规、便常规、凝血功能、血生化、心电图、其他实 验室检查（乙肝表抗、胸透、B超）；、不良反应观测（NCI-CTC 3.0标准）。2 .疗效性观测项目主要相关症状与体征；瘤体变化观测（影像学）；相关理化检查（月中瘤标志物、免疫 功能）；道常驻菌指标；体重变化观测；行为状况观测（卡氏评分、生活质量评分）。3 .时点1）受试者在回输后第1个月，按照每周一次、连续三周接受体检及不良反应记录 存档。体检包括

24、：成像，MRD评估，骨髓 穿刺，活检和/或淋巴结 活检，抽血进行血 清中细胞因子水平检测，化学检测，以及 19CART细胞存有量的实验室检测。2）受试者在回输后第 26个月，按照每月一次进行评估。3）受试者在回输后0.52年内，按照每3个月一次进行评估。4）受试者在回输后的35年内，按照每年一次进行评估。（六）疗效评定标准根据以上观测结果，进行疗效判定：以月中瘤细胞比例变化作为疗效的主要标准（治愈情况）；临床症状改善情况；治后生存期（生存率）；月中瘤无进展时间；生活质量评价；免疫功能评价；毒性反应（不良反应）评价。（七）统计方法：1、患者入组及分析人群描述描述入组人数，全分析集、符合方案集和安

25、全集人数及其剔除人数，描述试验病例 脱落情况。2、基线数据统计描述和分析描述治疗前各种医学检查指标基本情况。对分类数据，计算各类例数及比例。3、安全性分析安全评估指标包含所有的不良反应，严重不良反应，血液学及生化学资料等所有的 毒性评估根据NCI一般毒性标准4.0版分级。停止后30天内PD死亡的不需要报，PD死亡 的或PD住院的不需要报。4、疗效分析受试者接收19CART细胞输注后随访时或受试者需要替代治疗时，医生判定疗效 和评估病情的依据包括：症状体征、血常规、血清生化、外周血涂片检查、骨髓涂片检 查、骨髓染色体核型分析、脏器功能检测、淋巴结活检、CT、白血病微小残留检测、免疫功能检测、抗白

26、血病效应（GVL/RVL ）等。（八）试验的质量控制与保证为确保本研究严格按临床研究方案进行，在本研究整个过程中，临床研究者、中办者及临床监查员均应严格按照GCP要求进行操作，务必做到试验程序规范，试验数据 准确，研究结论可靠。所有的有效病历均需最终数据审核合格后， 方可确认为有效病历。（九）进行CRISPR联合CAR-T技术的基础研究常规CAR-T方案基因插入具有随意性，而应用 CRISPR技术可以做到精确定点插 入目的基因，完成2-3例患者的基础研究。可行性分析我科在医院的大力支持下已经开展了 CTL+DC细胞治疗，共进行了 130余例次的 免疫细胞输注，积累了丰富的免疫细胞治疗经验，同时

27、培养了一批具有丰富细胞治疗经 验的临床医师、护士及实验室人员。本研究的细胞制备拟在我院临床干细胞中心进行，我院临床干细胞研究中心成立 于2006年，占地面积约500平米，目前主要由2个GMP车间、科研区及各自的附属区 构成，GMP车间及附属区因功能不同而分别达到 B级、C级洁净度，可以满足临床级 细胞移植时制备细胞的要求。科研区及附属区配置有先进的能够快速分选干细胞的流式 细胞分选仪、全自动化的免疫组织化学染色成像系统、尼康共聚焦成像显微镜、定量 PCR仪等各类实验仪器。临床干细胞中心可以为本项目开展免疫细胞制备、研究提供良好的工作平台。六、项目组成员的人才培养计划：本研究课题在临床方面可培养

28、一批对淋巴瘤免疫细胞治疗尤其是CART治疗具有丰富经验的临床医师，在临床干细胞中心GMP实验室可建立免疫细胞治疗完整的操作流程及规范，为我院其他科室免疫细胞治疗提供参考依据。本研究可培养博士研究生1-2人，硕士研究生2-3人。七、项目预期目标1、项目解决的关键问题以及预期达到的水平：（限500字）（国际领先、国际先进、国内领先或填补院内空白）1、选择难治复发B细胞淋巴瘤患者，进行第三代 CAR-T免疫细胞治疗，评价 CAR-T免疫细胞治疗的有效性及安全性，国际先进；2、在CAR-T免疫细胞治疗前后检测患者各种免疫细胞及细胞因子，评价这些指标在预测细胞因子风暴（CRS）严重程度中的作用，国际先进；3、建立常规CTL、DC+CTL等细胞治疗及细胞培养标准操作流程，国内领先；4、建立我院免疫细胞治疗平台，规范血液科免疫细胞治疗流程，国内领先。2、社会效益（限500字）