细胞免疫组化（精编版）

1、WORD格式细胞免疫组化细胞爬片的免疫组化1. 细胞爬片， 5 天后进行免疫细胞组织化学染色定。2. PBS 清洗标本3 次各 1min 。3. 冰丙酮固定15min( 或 4%多聚甲醛固定30min) 。4. 空气干燥 5min。5. PBS清洗标本 3 次各 2min 。6. 0.5%TritonX-100(DPBS配) 孵育1 次 20min。7. PBS清洗标本 3 次各 2min 。8.3%H2O2（试剂 A）孵育 15min 。9. DPBS清洗标本 3 次各 2min。10. 封闭血清孵育（试剂B） 20min 。11. 一抗孵育（滴度1： 200，湿盒） 4过夜或 37 60m

2、in 。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液12.PBS 清洗标本3 次各 5min 。13 . 二抗工作液孵育（湿盒试剂C） 37 30min。14 .PBS 清洗标本3 次各 5min 。15. 试剂D（湿盒）3730min 。16、PBS清洗标本3 次各5min。17、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约310min。专业资料整理18、蒸馏水洗2 次 1min。19、苏木素复染0.51min 。20、自来水洗返蓝。21. 梯度酒精脱水75， 85， 95， 100%各 3min 。22. 二甲苯透明2 次 3min 。23、中性树胶封片。注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细

3、胞的基础，要获得良好细胞爬片须注意以下：a 对于粘附分子较少的细胞爬片时间要达5 天以上这样细胞爬片才较牢固冲洗时不易脱片；b 接种的细胞密度适中以2*104/ml为宜，若密度太高5 天后细胞连接成片冲洗时易脱片；2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4C 冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或 2%多聚甲醛固定。3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、TritonX-100表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在 胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。细胞爬片

4、固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？1. 如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些， 但是做的时候要防止脱落。如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24 孔，或 6 孔板里做才可以。中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。2. 孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。3. 我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这样做很少掉片。先将消化好的细胞悬液滴几滴在盖玻片上，由于液体的表面张力，细胞悬液一般不会流淌到盖玻片外面，等细胞大概

5、贴壁后，不同细胞贴壁时间稍有不同，大概6、7 个小时，差不多贴壁再加生长液，开始滴的细胞的数量你要摸索一下， 到固定时细胞生长到80左右比较合适。偶是在盖玻片上做的，首先细胞要爬的匀一些，象dongwp战友的就很好。然后倾去生长液冲洗、固定之后，用小镊子或手指把玻片从六孔板拿出来。擦干盖玻片的背面，在玻片WORD格式背面四周涂一点凡士林，粘贴于载玻片上，这一点很重要，在以后的操作里会省去盖玻片经常脱落麻烦。细胞爬片的保存和抗原修复问题总结1.体浓度细胞爬片可以用, 请告知 . 多谢 !含叠氮钠PBS液保存. 但不知道具0.04-0.08%。但是我建议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必

6、要的问题!2. louischenwrote:但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?!丢失3. mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定 , 固定液需加DEPC水。其它建议用甲醇固定。-20 度保存4. 如果是 4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。时间再长就没试过了。5. 丙酮中固定5-10 分钟，然后风干，放置4 度保存过WORD格式夜应该是没有问题。不要固定过夜，蛋白质固定过度，会影响抗原的暴露，影响免疫组化结果。如果是胞浆或胞核抗原出现假阴性结果，可考虑应用0.5%的 triton-100孵育 30 分钟，渗透

7、细胞膜。如果玻片没有经过特殊处理，不要用其他抗原修复的方法，会造成掉片，我曾有过这方面的体会6. 丙酮固定后， PBS洗涤 3 次，即可保存至4 度冰箱备用。7. (1) 细胞爬片先用TBS洗 3 次，每次 5 分钟(2)4% 多聚甲醛固定，室温，20 分钟(3)70%-80%-90%-95%-100%梯度酒精脱水，通风橱内干燥，-80度保存。 2 周没有问题的，我保存过2 个月都有信号，不过还是保存时间短一点的好8. 我的心肌细胞爬片用不同浓度的乙醇依次脱水后, 就放在室温中 , 因为是要拍电镜,但是学校电镜坏了, 呵呵, 所以放了一个月后去拍, 还是很好9. 细胞爬片用4%多聚甲醛或冷丙酮

8、等固定，用PBS冲洗后，晾干，放在-20 度保存一个月没有问题的。10. 细胞爬片，有机溶剂如4%多聚甲醛或冷丙酮等固定后，轻轻摇动玻片或培养皿等，静置2min左右，弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-70 长期保存。解冻时要小心抗原破坏，应先将标本转移于干冰预冷的固定液，然后再将混合液转移至室温下，固定液到达室温时取出标本，再用PBS冲洗，在做以后的步鄹11. 我也做过细胞爬片的组化染色，不过没有遇到类似的问题。细胞培养好后用PBS洗一遍，然后4%多聚甲醛 4度固定 15 分钟，自然风干。室温保存几周内都可以用的。我想这可能与抗原的类型有关，有的对氧化等损伤比较敏感，

9、有的差一些。最好避光保存在4 度，同时尽量隔绝空气。免疫荧光与普通DAB显色差别只再二抗的标记，样品的保存应该是没有多大差别的。12. 细胞爬片丙酮固定后-20 度保存，现在要再做免疫荧光，将保存的爬片拿出37度复温然后常规操作就可以了13. 爬片做免疫组化的优势在于抗原新鲜，细胞形态保存较好。若爬片需长期保存并出现你这样的问题，原因可能是： 1) 试验步骤有误，建议重复并加阳性对照片。2) 加一抗前处理同石蜡切片，可进行抗原修复，如胰酶消化或热修复。3) 因为抗原抗体反应在液相中进行，故对已极度干燥的爬片充分水化很重要。建议试验前用PBS浸泡过夜。如不能解决你的问题请QQ联系： 818256

10、45。本人在湖南省肿瘤医院病理科( 长沙市 ) 做免疫组化。14. 4%多聚甲醛或冷丙酮固定都可以，也有用无水酒精的，固定好后放-20度，2-3 个月是没有问题的。15. 对于一般的细胞免疫组化，我的做法是：细胞爬片用冰的纯丙酮固定20MIN，再在通风柜将丙酮吹干，-20WORD格式度保存，用丙酮固定作用是沉淀蛋白质和糖，穿透性很强，保存抗原的免疫活性好。所以丙酮常用做细胞细胞爬片的固定剂。当然还是要根据你的实验目的决定用那种固定剂。1. 多聚甲醛 ( 常用 4%)：可用于免疫电镜; 也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)

11、、主要组织相容性抗原等2. 乙醇。优点：穿透性强、抗原性保存较好。缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解; 染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度3. 甲醛( 福尔马林 ) 应用最广优点：形态结构保存好，且穿透性强，缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH 降低，影响染色; 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴 性的染色结果。16.4 度是不能保存这么长时间(1 个月 ) 的，如果抗原已被分解，再修复也没用!17. 弃去固定液，不用PBS洗而是采用空气干燥，干燥后的标本可于-7

12、0 长期保存。18. 爬片置于37 度PBS中洗三次，每次3 到5 秒钟， 然后在4%多聚甲醛中固定15 分钟，然后再用37 度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在-20 保存备用， 具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。19. 固定后放点PBS，然后放在4 度冰箱中保存，我最长保存两个月的，然后再做免疫组化，应该没有太大的问题的。20. 固定后 4 度可以存放一周，-20 度存放半年，我现在也要做这个

13、，实验室老师教的。21. 四度放 1 周应该没问题的，你最好放在-20 度，我在-20 度放一个月都还出结果的. 很多人作的片子很多，不可能一次作完，一个月没问题.22. 最佳的固定及保存方法：(1) 中性缓冲福尔马林( 不必调 pH)：马林 (40%甲醛，用时加入过量碱式MgCO3中和 )10.0mlNa2HPO4.12H2o1.9653g NaH2PO4.2H2O0.5460g0.85%NaCl 溶液溶解，定容至100ml。(2) 细胞固定：待细胞接近长成单层时，用镊子取出盖玻片，迅速于37 PBS中漂洗 2 次，每次 3-5秒，以清除血清。(3) 将盖玻片投入中性缓冲福尔马林溶液中室温固

14、定30min 。(4) 用镊子取出盖玻片，PBS漂洗 2 次，每次 3-5 秒， 晾干保存于 -20 备用。可长期保存，做实验时，取出片子，入 PBS湿润后即可进行你的实验。(H.E.)或免疫荧光。( 本帖没有加分 )23. 细胞爬片固定以后要放在-20 度的冰箱 .1个月内可以用.24. skywalkerzzwrote:过氧化氢处理这一步，用三蒸水稀释商品浓度为30%的过氧化氢，然后室温下玻片放在其中浸泡 10min ，是不是过氧化氢导致细胞严重脱片?/ 双氧水，你的细胞极可能是过氧化氢导致严重脱片25. 本人比较喜欢用4%得多聚甲醛，20 分钟很好用的。保存的时候注意片子最好晾干，不要挤

15、压，防止粘片和碎裂。26. 细胞爬片固定好以后，如果要保存，我们的做法是倒掉固定液， PBS漂洗后干片保存在4 度，最长半年没问题。27.1 、用新鲜配制的预冷的4%多聚甲醛缓冲液室温固定15min， PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗涤 3 遍后是否就可以进行免疫细胞化学染色了2、爬片 PBS(0.01mol/l,pH7.4)洗涤 3 遍后是否能保存，怎样保存 ?1、洗过就可以做免疫组化了。2、固定过后自然干燥，不要洗，-20 度保存。做之前再洗。28. 细胞固定最好用丙酮或酒精，不要用4%多聚甲醛，以免抗原交联，这样组化时不用再抗原修复。细胞固定后可室温保存在丙酮中，不使之干燥。2

16、9. 如果是检测膜上的物质, 好象不能用酒精,30. 适当密度后取出固定( 丙酮 -20 固定 1020min) ，再进行免疫染色。31. 一批细胞爬片 , 如果细胞爬片是在玻璃上，冷丙酮固定15-20 分钟，然后放 -20 度，没有问题。24 孔板或 6 孔板里进行，冷丙酮会腐蚀板子，最好4%多聚甲醛。32. 细胞爬片用纯丙酮固定10 分钟，取出干燥后用锡纸包裹，-70 度保存。33. 4%多聚甲醛固定后PBS 水洗，自然干燥后用锡纸包裹，-20度冻存不超过1 月。34. 如果细胞贴壁困难，可将片子先用纯血清挂一层，凉干后再养细胞。35.可以买 NUNC公司的专用细胞培养用盖玻片，商品名Th

17、ermanox™Coverslips。高分子材料，耐高温灭菌，经过特殊表面处理，细胞容易贴附。可以用剪刀任意裁剪，使用效果好。果比玻璃盖玻片效果好很多。36.我们通常是把细胞玻片固定好后，用PBS冲洗干净，然后用酒精脱水(80%，90%，100%， 100%酒精各一次，每次10 分钟左右 ) ，然后放在烘箱里烘干，这是就相当于石蜡切片了，可以保存一定的时间。可以的。免疫细胞化学染色操作规程一、材料和1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用处理玻片。2%多聚赖氨酸包被2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。WORD格式4、0.01

18、MPH7.4PBS5、1%BSA-PB（S 含 0.05%Tween20）6、AEC底物（ 1）底物缓冲液（20X） PH4.6醋酸（分子量60.6 ）30.6ml Triton-100醋酸钠3H2O（分子量 136.1 ） 66.68 克加蒸馏水到960ml，调 PH到 4.6 ，最后加蒸馏水到总体积1000ml（ 2） AEC（ 20X）AEC15mg/m，l溶在 DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2分子量 73.10 中）（ 3） 0.6%H2O2（ 20X）临用时，（ 1）（ 2）（ 3）各 50ul ，在 1ml 双蒸馏水中混匀30分钟内有效。7、DAB（即 DAB-4H

19、CL）（ 1） 1.5 克 DAB在 100ml 水溶液中（ 20X）（ 2） 1MTris （ 20X），用 HCL调 PH到 7.4（ 1）（ 2）（ 3）各滴加入1ml 二蒸水中，新鲜配，避光， 30分钟内有效。溶解后（可加热到500C），加水合氯醛50 克（水合氯醛ChloralHyclrate，分子量 165.4 ），枸橼酸1 克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或40C保存。8、苏木素复染液苏木素1 克碘酸钠0.2 克钾矾50 克水1000ml9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。10、3%H2O：2 30%H2O21 份，加9 份双蒸水，临用时配。11、细胞抗原玻片及96 孔细胞

20、抗原板（见ICCprotocol04）12、封片液：1 克明胶，溶于30ml350C水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用0.6ml水中）。HRP标记二抗或SP法时必须阻断）1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或370C10-15分钟，使恢复温度。2、加 3%H2O，2 细胞片 20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分覆盖住细胞。3、室温 10 分钟后，甩掉H2O2，用 PBS轻轻淋洗 2 分钟。用滤纸吸干细胞周围水份，96 孔在滤水纸上扣干，但注意保持细胞湿润。三、封闭细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/ 孔），细胞板用2-5

21、%BSA（ PBS 配制） 100ul/孔，置 370C孵育 30 分钟后甩掉封闭液，不洗。四、免疫化学染色1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分覆盖细胞。371 小时或 4冰箱过夜；2、弃去一抗，如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1 次后， 浸于 100mL含 PBST洗杯，漂洗（最好在慢速摇床上）3-5分钟，转入第二杯PBS（1000ml），如上法漂洗 3-5分钟。擦干细胞片周围水分，96 孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5 分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿润，反复3-4 次；3、加 S.P （ S.P 法，即放大法）（

22、1）加已优选好的浓度的Biotin标记二抗，细胞片10ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。 37温和孵育30 分钟；（ 2）按免疫化学染色“2” 所述方法洗涤和擦干；（ 3）加已优选好浓度的S.P，用量同 “ （ 1） ” ，37孵育 30 分钟后按免疫化学染色“2” 法洗涤及擦干；4、间接法加二抗（不放大法）方法同 S.P 法，但不用Biotin标记二抗，而改用HRP直接标记二抗。并省略（3）步骤；5、加底物显色（ 1）、加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞

23、玻片20ul/孔，板 50ul/孔，置于37恒温箱孵育5-10 分钟，一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满意的结果（阳性对照显色程度为“+”），用自来水即可终止反应；（ 2）、复染：苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加苏木素复染液1-2 滴， 1分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素，再浸于PBS中约 30 秒钟返蓝色，最后在蒸馏水中漂洗。6、封片洗后细胞片擦去周围水分，滴加1 滴甘油明胶封片液，加盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。五、结果判断KSHV阳性诱导后BCBL-1 细胞有 10%-30%显红色，强度不一，未诱导BCBL-1 阳性细胞（ 1-30%）阴性诱导和未诱导BCBL-1 细胞完全不显色（排除边缘效应）MCMV/HVMV阳性感染病毒的细胞有病灶反应，显红色，强度不一，未感染细胞不显