真菌DNA大量提取

1、核裂解法大量提取真菌 DNA一、试剂的配制1. EDTA-Na2（ 0.1 M）：称取 3.72 g Na2EDTA·2H2O，用超纯水定容至 100 mL。2. Tris-HCl（1 M，pH）：称取 12.11 g Tris-HCl ，用 90-95 mL超纯水溶解，调 pH至 8.0后，在定容至 100 mL。3. 核裂解液 （10 mM Tris-HCl,400 mM NaCl ，2 mM EDTA-Na 2，0.8 mM 盐酸胍）： 分别称取 76.43 g盐酸胍， 23.38 g NaCl于 1 L烧杯中，加入灭菌超纯水充分 搅拌溶解至 900 mL，再加入 10 mL

2、1 M Tris-HCl 和 20 mL0.1 M EDTA-Na 2， 搅拌溶解，调 pH 至 8.0，定容至 1000 mL，高温灭菌，冷却待用。4. SDS（20%）：称取 20 g SDS，灭菌超纯水定容至 100 mL。（SDS 不能采用 高温高压灭菌）5. 盐酸胍：强烈变性剂，可溶解蛋白质，导致 细胞结构 破坏，核蛋白二级结构 破坏，从核酸上解离下来，此外， RNA 酶可被盐酸胍等还原剂灭活。二、操作步骤1. 称取液体培养基 PPDA 培养样品 1.0-1.5 g（可用灭菌超纯水或 TE 缓冲液清 洗 1-2 次），研钵先用液氮预冷， 再将样品用液氮研磨， 直至全部研磨成均匀 粉末

3、。2. 转入预装 5 mL（ 与样品质量比为 1:4-1:6 ）核裂解液的 15 ml 离心管中，加入 60 l 50 mg/mL 蛋白酶 K（80-150 l，20 mg/mL），10 l RNase A充分震荡 15s混匀。3. 加入 500 l 20% SDS（终浓度 1%-5%），震荡混匀。4. 56-65水浴，约 3 h，至出现较多上清，期间不断颠倒混匀。5. 冷却后， 4， 6000 rpm，离心 10 min，吸取上清至另一新的 15 mL 离心管 中。6. 加入 10 l -巯基乙醇（终浓度 0.02%），再加入等体积的酚 /氯仿 /异戊醇 （25:24:1），颠倒混匀 30次

4、左右， 6000 rpm，离心 10 min。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡）7. 吸取上清至另一新的 15 mL 离心管，注意不要吸到中间蛋白层。8. 如果上清十分浑浊，可用等体积氯仿 /异戊醇（ 24:1）再抽提一到两次，同样 6000 rpm 离心 10 min，将上清转至新的离心管。（该步骤须在通风厨中进行， 颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡）9. 加入等体积 -20预冷的异丙醇（可先加入 1/10体积 3 M，pH5.2的 NaAc， 沉淀效果更好），轻柔颠倒混匀，如果 DNA 沉淀呈絮团状，可用移液枪枪头 或干净玻璃棒将 DNA 絮状沉淀挑出，若DNA 不呈

5、完整絮状沉淀或沉淀较少， 可在-20 冰箱放置 1-2 h促沉淀。10. 若 DNA 沉淀无法直接挑出， 可 4，6000 rpm，10 min 收集沉淀，弃尽上清， 挑出 DNA 沉淀。11. 将DNA沉淀转入 2 mL EP管，加入 1 mL预冷的 70%乙醇，轻弹管壁重悬 沉淀。混匀洗涤 2-3次，以去除残余的盐， 12000 rpm，2 min 弃尽上清。12. 加入 1mL 预冷的无水乙醇， 轻弹管壁重悬沉淀； 12000 rpm，离心 2 min。（动 作轻柔，不可剧烈震荡，避免造成 DNA 断裂）13. 室温放置 10-15 min 左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积的灭菌超纯水

6、或 TE 缓冲液溶解。CTAB 法大量提取真菌基因组 DNA一、试剂的配制1. CTAB （十六烷基三甲基溴化铵） 提取液（PH 8.0）：2% CTAB（w/v），1.4 M Nacl，0.02 M EDTA ，0.1 M Tris-cl ，0.2%巯基乙醇。即称取 CTAB 2 g 加蒸 馏水 40 ml，加 1M Tris-cl（PH8.0）10 ml，0.5 M EDTA（PH 8.0）4 ml 和 5 M NaCl 28 ml（约 8.19 g NaCl），于 65下溶解，用蒸馏水定容到 100 ml，最 后 pH 值 8.0，灭菌后加入 0.2 ml - 巯基乙醇。2. 1 M T

7、ris-cl（PH 8.0）：12.11 g Tris碱；ddH2O，80 ml；HCl ，4.9 ml 三者混匀 充分溶解后，滴加浓盐酸调 PH至 8.0，定容至 100 ml。3. 0.5 M EDTA （PH 8.0）：在 80ml 水中加入 18.01 g EDTANa2·2H2O 搅拌溶 解，用 NaOH调 PH 至 8.0（约 2 g NaOH颗粒），定容至 100 ml。4. 5 M NaCl 100ml ：称取 29.22 g NaCl ，用ddH2O定容到 100 ml。5. 3 M NaAc 10ml：称取 2.46 g NaAc，用 ddH2O定容到 10 ml

8、，pH5.2。6. TE溶液： Tris-HCl（pH=8.0，1 mol/ L ）5 ml，EDTA（pH=8.0，0.5 mol/ L）1 ml ，加 ddH2O 定容到 500 ml ，PH8.0。二、操作步骤1. 称取液体培养基 PPDA 培养样品 1.0 g，研钵先用液氮预冷， 再将样品用液氮 研磨均匀，直至全部研磨至粉末，转入 15 ml 离心管中，加入 4 mL（ 与样品 质量比为 1:4-1:6 ）65预热的 CTAB 溶液（用前加入 0.2%的 -巯基乙醇）， 充分振荡混匀。2. 65水浴，约 45 min-60 min，期间颠倒混匀 3-4 次。3. 冷却后，加入等体积的酚

9、： 氯仿：异戊醇 （25:24:1），颠倒混匀 30 次左右，12000 rpm，离心 15 min。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧 烈震荡）4. 吸取上清至另一新的 15 mL 离心管，注意不要洗到中间蛋白层。5. 加入等体积氯仿 :异戊醇（ 24:1），12000 rpm，离心 15-20 min，若上清仍十分 浑浊，可重复 2-3 次。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免 剧烈震荡）6. 吸取上清，转入新的离心管中，加入 1/10体积的 NaAc（3 M，pH5.2）。7. 加入等体积 -20预冷的异丙醇或两倍体积的无水乙醇颠倒混匀后置于 -20 冰箱放置

10、 1-2 h。（颠倒混匀动作轻柔， 不可剧烈震荡， 避免造成 DNA 断裂）8. 12000 rpm， 10 min 弃上清。9. 向离心管中加入 70%的乙醇至管中 2/3 体积，混匀洗涤 2-3 次，以去除残余 的盐， 12000 rpm，2 min 弃尽上清。10. 室温放置 10-15 min左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积 ddH2O或TE 缓 冲液溶解，同时加入 2-10 lRNA酶A，混匀， 37水浴 30-60 min。准备药品： Tirs 碱、浓盐酸、 EDTANa2·2H2O、NaOH、NaCl、CTAB、酚、氯仿、异 戊醇、无水乙醇、 NaAc、液氮、巯基乙醇

11、 研钵、恒温水浴、离心机、离心管三、基本原理样品在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁， 游离出细胞器和原生质， 并防止 DNA 降解。采用 CTAB （十六烷基三甲基溴化胺，一种非离子型去污剂）抽提 液抽提（ 65）上述研磨物。在低离子强度溶液中 CTAB 具有沉淀核酸与酸性 多聚糖的特性，在高离子强度的溶液中 （0.7mol/L NaCl）,CTAB 溶解细胞膜相物 质，与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去 除蛋白、多糖、酚类等杂质后经过多次乙醇漂洗和沉淀， 用 RNase水解 RNA ， TE 缓冲液或已灭菌超纯水溶解得到较为纯净的 DNA 粗提物Tris-HCl

12、 （pH8.0）提供一个缓冲环境 ,防止核酸被破坏； EDTA 螯合 Mg2+或 Mn2+离子,抑制 DNase 活性； NaCl 提供一个高盐环境，使 DNA 充分溶解，存 在于液相中； -巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚 容易去除基因组 DNA 。蛋白质的去除：酚 /氯仿抽提使用变性剂变性 （SDS、异硫氰酸胍等 ）高盐洗涤 蛋白酶处理核酸分离，纯化；多糖的去除：高盐法，用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量 的氯苯（1/2 体积），氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用 P

13、EG8000代 替乙醇沉淀 DNA ：在500 L DNA液中加入 200l 20% PEG8000 含（ 1.2 M NaCl） ， 冰浴 20min.核酸分离，纯化；多酚的去除 :在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂： -巯基乙醇、抗坏血酸、 半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP（ 聚乙烯吡咯酮 ）,PEG（聚乙二醇 ），它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与 DNA 的结合；盐离子的去除： 70%的乙醇洗涤核酸吸附，沉淀和溶解使用合适的吸附材 料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化 DNA 的目的另一种方式加入 1/10 体积的 NaAc（pH5.2,3M） ，用预冷的乙

14、醇或异丙醇沉淀 RNA 吸附或沉淀后应用 70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用 TE 缓冲液溶解 TE 中的 EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制 DNase，pH值为8.0，可防止 DNA发生 酸解。DNA 中含有蛋白、多糖、多酚类杂质。 DNA 在溶解前，有酒精残留，酒精 抑制后续酶解反应， DNA 中残留有金属离子，有 RNA 的存留。对策：重新纯化 DNA ，去除蛋白、多糖、多酚等杂质，重新沉淀 DNA ，让酒精充分挥发，增加 70%乙醇洗涤的次数 （2-3 次），加入 RNase降解 RNA。四、 DNA 质量检测1. 取2-5 l DNA，加1l 6上×

15、;样缓冲液混匀，以HindIII DNA marker 作为 分子量标准，在 1×TAE 缓冲液中于 120 V 进行琼脂糖凝胶电泳 20-30 min，于紫外成像仪中拍照，检查 DNA 的质量；2. 取待测 DNA 样品 10 l至一洁净的离心管中， 加蒸馏水稀释至 2 mL ，转 入到洁净的石英比色皿中，以等体积蒸馏水作为空白对照，于快速核酸 蛋白分析仪或分光光度计上测定 OD260及 OD280，根据 OD260 计算 DNA 的浓度，并以 OD260/OD280 的大小确定 DNA 的质量；五、常见问题1. 用酚抽提细胞 DNA 时，有什么作用？有什么优点？ 苯酚：使蛋白质变

16、性，同时抑制了 DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时 ,由 于蛋白与 DNA 联结键已断 ,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的优点：有效变性蛋白质；抑制了 DNase 的降解作用。缺点：能 溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly（A）RNA 。不能完全抑制 RNase 的活 性。2. 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿异丙醇抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。 （酚易溶于氯仿中）3. 用酚 -氯仿抽提细胞基因组 DNA 时，通常要在酚 -氯仿中加少许异戊醇，为什 么？异戊醇：减少蛋白质变性

17、操作过程中产生的气泡。 异戊醇可以降低表面张力， 从 而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含 DNA 的水相、 中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。4. 用乙醇沉淀 DNA 时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如 NaCl 或 NaAc， Na+中和 DNA 分子上的负电荷， 减少 DNA 分子之间的同性电荷相斥力， 而易于 聚集沉淀。5. DNA 样品不纯，抑制后续酶解和 PCR反应。 DNA 提取常见问题：材料不新 鲜或反复冻融、未很好抑制内源核酸酶的活性、提取过程操作过于剧烈， DNA 被机械打断，外源核酸酶污染反复

18、冻融。 尽量取新鲜材料， 低温保存材料避免反 复冻融，液氮研磨或匀浆组织后， 应在解冻前加入裂解缓冲液。 在提取内源核酸 酶含量丰富的材料的 DNA 时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后 续操作应尽量轻柔。所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌。将 DNA 分装保 存于缓冲液中 ,避免反复冻融。6. DNA 降解， DNA 提取常见问题。实验材料不佳或量少，破壁或裂解不充分， 吸附或沉淀不完全，洗涤时 DNA 丢失。尽量选用新鲜 （幼嫩 ）的材料，动植物要 匀浆研磨充分； G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时， 时间适当延长 （对于动物细胞 ,细菌可增加 PK 的用量 ）。增加吸附的时间、或低温 沉淀小心操作。7. 要用冰冻材料提出高质量的基因组 DN