基因测序技术在猪蓝耳病防控中的应用

1、基因测序技术在猪蓝耳病防控中的应用伍少钦 曹玉美 陆江 蒙春宁 肖有恩（广西农垦永新畜牧集团有限公司良圻原种猪场 南宁横县 530317）摘要： 2010 年对公司历年保存的 PRRSV 阳性血清和部分问题猪经 RT-PCR 检出阳性血清，先后送样 8 次共 62 个样品，成功测序 59 个，用 DNAStar 剪切出完整的 ORF5 序列，进行基因比对和进化树分析，发现 核苷酸置换率为 58%，同源性从94.7%100%不等，整体分化成两大类； PRRSV表现出明显的区域性和 时间性，各个商品猪场间的序列均有所差异，不同时间段的样品也有差异。 测序结果与目前市面上的疫苗株 ch-1a、ch-

2、1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP 和 RespPRRS MLV 比对，发现公司商品猪场近 4 年流 行的PRRS毒株与HUN4-F112、JXA1比较接近，表明目前流行的 PRRSV以变异株为主。关键词：猪；蓝耳病； ORF5;基因测序；进化树、, 、-前言在分子生物学研究中， DNA 的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用 于测序的技术主要有 Sanger 等（ 1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam 和 Gilbert （1977 ）发明的化学降解法。 这两种方法在原理上差异很大， 但都是根据核苷酸在某一固定 的点开始，随机在某一个特定的碱

3、基处终止，产生A、T、C、G 四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的 PAGE胶上电泳进行检测，从而获得 DNA序列。DNA测序技术的目 的：测定未知序列；确定重组 DNA 的方向与结构；对突变进行定位和鉴定；比较研究。PCR检测技术在上世纪 90年代已经应用在动物疾病的检测中，但由于成本较高，检测 量相对较少。2005年后，PCR和 RT-PCF技术在养殖动物的疫病检测中开始普及应用。基因 测序技术， 由于早期成本高，仅限于少数科研院校，近年来随着测序成本的大幅下降，近一两年来国内部分规模养殖场开始应用这项技术， 尤其以研究猪蓝耳病病毒的演变进化最为常 见，测序技术在 PRRS的控制与

4、净化中显示出其独到之处。1 材料与方法1.1 仪器与试剂1.1.1 仪器： Takara TP 600、英国 UVI 凝胶成像系统、 Hettich MIKRO 22R 冷冻离心机、北京 六一电流仪和水平电泳槽、净化操作台等。1.1.2 试剂：Taq酶、M-MLV、RNA 酶抑制剂、Trizol、DNA Maker 等。1.1.3 引物合成与测序公司：上海英骏生物技术有限公司广州分公司。1.2 方法用常规RT-PCR方法检测出PRRSV阳性的样品。样品经克隆或经 PCR大量扩增后送测序公司进行测序。1.2.3 用 DNAStar Lasergene 7.1 进行序列分析， 比对各个样品的测序结

5、果， 并制作 PRRSV ORF5的演变进化树。2结果与分析2.1全部检测结果与分析2010年公司各商品猪场测序的59个PRRSV阳性样品，剪切出完整的0RF5基因片段(603bp)，进行整体0RF5比对，发现核苷酸置换率为 58%,两两相互比对，同源性从94.7% 100%不等，整体分化成两大类；PRRSV表现出比较明显的区域性和时间性；各猪场的序列相对都有所不同，不同的时间段检测相对也有所不同。与目前市面上存在的疫苗株ch-1a、ch-1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP和RespPRRS MLV进行两两比对，发现公司商品场近 4年流行的PRRSV毒株与HuN4-F

6、112、JXA1比较接近，说明目前流行的以变异株为主(详见 表1)。表1商品猪场59个样品与市面疫苗 ORF5同源性比较疫苗毒株名最小相似(%)最大相似(%)疫苗毒株名最小相似(%)最大相似(%)RespPRRS MLV88.2089.00Ingelvac ATP89.2090.80ch-1a93.5095.00ch-1R92.7094.20JXA197.2098.70HuN4-F11296.5098.302.2商品猪场A检测结果与分析为进一步了解PRRSV测序技术的应用，以A猪场为例进行详细分析，A猪场病料的来源见来源于产房弱仔、产房母猪、保育病猪和流产母猪(见表2),表明PRRSV寸各阶段

7、猪只都有影响。表2广西农垦永新畜牧集团A商品猪场20102011年样品送检测序情况表编号猪只状态耳号收样时间测序时间说明(临床症状)1不详2008 年20100205发病猪8保育猪-2010020120100205发病猪9保育猪-2010020120100205发病猪18保育猪-2010060320100707发病保育猪22产房母猪4头J222104、 J39601、J200802、 J396106201007082010070144头混合样品25后备猪24840620100712201007014发烧26产房弱仔-20100712201007014产房第4栋30保育猪-20100729201

8、00812第3栋发病31保育猪-2010072920100812第6栋发病32保育猪-2010072920100812第7栋发病337周龄保育猪-20100801201008128月季度检测(发病)34保育猪-2010072920100812第8栋发病359周龄保育猪-20100801201008128月季度检测(发病)41断奶弱仔-2010100620101010产房5断奶弱仔:43流产母猪424903J2010101120101014流产母猪51流产母猪J164902、 K2487082010122120110117流产母猪52保育病猪-2010121120110117保育病猪54产房弱仔

9、-2011010520110117产房仔猪保育-2010122120110117发病保育猪对A猪场20个PRRSV测序结果剪切出的 ORF5片段（603bp）进行比对分析，两两比较 同源性从95.5%100%不等，PRRS病毒的进化树如图1，整体核苷酸置换率为 53%, A猪场 的PRRSV寅变成两大类。测序结果表明 A猪场内至少存在2种不同的PRRSV对2010年8月12日送测序的结果比对分析，发现同源性从96.2%100%,表明当时7月份采血的发病猪的 PRRSV相互间存在差异，可能存在3个毒株，编号30、32和34同源性为100%,为同一毒株；编号 31和33同源性为100%,为同一毒株

10、，编号 35号与其他的 不同，为另一毒株（详见图2 ）。.-.7 -I：:h ' ' I代订.：' - ： |：'图1 A猪场PRRS ORF5基因进化树Percent Identity1234561962100.097.5100097.5123 995.296296296.22 3003.997.5100.097.53 -42.53.925975100.04 :50 03.9002.597.55 ；G2.53.925002.56 :1234563 0-GXYX-YP- byz-3D-20100729seq35-GXYX-YP-byz-9W'2010OS

11、Oxseq34-GXYX-YP-byz-SD-20100729 seq33-GXYX-YP-byz-7W-2010OSOxseq3 2-GXYX-YP- byz-7D-2) 100729seq31-GXYX-YP-byz-6D-20100729seq图2 20100812送检PRRSV测序结果 ORF5上匕对结果对2011年1月17日送测序的结果比对分析， 发现ORF5的同源性在99.5%100%, PRRSV 在ORF5片段上的变异很小（详见图3）。表明去年12月份和2011年1月采集的发病猪很可 能是由一个新的毒株引起。Percent Identity123451100.0997100.0

12、99.5151-GXYX-YPJvlZLC(H2)-2) 101221 seq200997100099.5259-GXYX-YP-BYZ-20101221ZBseq3030.399.799.5354-GXYX-YP-CFRZ0110105seq400000.399.5456SXYX-YP-CFRZ-20101208 seq505050.505552SXYX-YP-BYBZ-20101211.seq12345图3 20110117送检PRRSV测序结果 ORF5比对结果3讨论3.1蓝耳病病毒和流感病毒类似，变异很快，甚至比PRRSV的变异更快。如何发现 PRRSV的变异，这就需要定期对 RT-P

13、CF阳性的产物或克隆产物进行测序，分析其序列是否发生变 异。长期跟踪测序，可以发现病毒在猪场内部的来源与演变，各个猪场之间是否存在交叉感染，病毒是引种带来还是内部的演变，可以大概推测出新病毒是应用新活苗引入还是通过人员引入等。3.2蓝耳病序列的变异大小与致病程度没有绝对的必然联系，虽然有时甚至发生1%差异，都会带来PRRS的爆发；但总体上看，一般来说序列分析同源性越高，即变异越小，对猪场 的危害也相对较小。假如猪场发生PRRS需要使用疫苗，如何挑选最合适的疫苗，应该对发病猪采集病料进行测序分析，筛选同源性最高的疫苗用于防制。比如A猪场发生问题，根据20110117的测序结果，与疫苗进行比对，可

14、以选择以HUN4-F112和JXA1毒株制成的疫苗 进行试用，因为这两个毒株与当时A猪场PRRSV勺同源性均在98%以上。3.3后备猪的驯化，尽可能用本场完全相似的PRRSV®株。目前国内外养猪业通用的方法是用本场血清（含 PRRSV或者用序列相似的活苗驯化后备猪。驯化三个月后，才引入母猪场 内，防止驯化期间排毒，引发母猪场出现疾病问题。3.4小区域PRRS的控制与净化方法已经非常明确，也非常有效，但PRRSV勺很多机理至今没有搞清楚，因此 PRRS还将是养猪业最重要的一个疾病。在机理没有明确的前提下，要想 长期控制与净化PRRS测序与分析工作对猪场的稳定显得十分必要。3.5蓝耳病的测序工作不单是某个猪场的问题，应该普及到整个省及国家层面上，建议交流与共享各个省市的测序结果，这样分析起来将更有意义。通过同源分析和进化树分析，甚至 可以分析某一新病毒的传播流行状况，到底是内部变异通过猪群、空气传播，还是疫苗本身或其他因素造成。在政府国家层面上进行猪PRRS勺控制与净化，收效将会更快。4结果59个样品经测序后剪切出 ORF5进行比对和进化树分析，发现核苷酸置换率为