丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备

1、项目四 丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备姓名：吴彩霞姓名：吴彩霞班级：生药班级：生药1313组别：第组别：第1组组学号：学号：2013040930指导老师：彭加平指导老师：彭加平 韦平和韦平和 王芳王芳一背景知识 丝氨酸羟甲基转移酶（丝氨酸羟甲基转移酶（SHMTSHMT）在自然界中普遍存在，它的生）在自然界中普遍存在，它的生理学功能是催化丝氨酸和甘氨酸之间可逆的互换。理学功能是催化丝氨酸和甘氨酸之间可逆的互换。 SHMTSHMT的催化反应是氨基酸和核酸代谢的连接点，在氨基酸的的催化反应是氨基酸和核酸代谢的连接点，在氨基酸的工业生产和植物的光呼吸过程中，工业生产和植物的光呼吸过程中，SHMTSHMT

2、也是一个关键酶。也是一个关键酶。 L-L-丝氨酸是氨基酸输液的重要成分丝氨酸是氨基酸输液的重要成分, ,化妆品的添加剂化妆品的添加剂, ,酶法生酶法生产色氨酸的前体物质。产色氨酸的前体物质。L-L-丝氨酸在体内代谢速度极快丝氨酸在体内代谢速度极快. .因此因此, ,直接发酵生产很困难直接发酵生产很困难. . 酶法合成酶法合成L-L-丝氨酸由于利用甘氨酸和甲醛特异的合成丝氨酸由于利用甘氨酸和甲醛特异的合成L-L-丝氨丝氨酸酸, ,具有原料来源方便具有原料来源方便, ,原料成本低和可合成高浓度产品等优原料成本低和可合成高浓度产品等优点点, ,因此是最有前景的因此是最有前景的L-L-丝氨酸生产方法丝

3、氨酸生产方法. .231 1、电泳是指带电颗粒在电场中将受到电场力的作、电泳是指带电颗粒在电场中将受到电场力的作用而发生泳动。用而发生泳动。2 2、这种特性，用电泳的方法对这些物质进行定性、这种特性，用电泳的方法对这些物质进行定性及定量分析，也可用于混合物的分离及定量分析，也可用于混合物的分离3 3、凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，、凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法4按分离原理：按分离原理：区带电泳区带电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳、移界电泳、等速电泳和聚焦电泳4 4种种区带电泳：区带电泳：电泳过程

4、中，不同的离子成分在均一的缓冲液中电泳过程中，不同的离子成分在均一的缓冲液中 分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。分离成独立的区带，这是当前应用最广泛的电泳技术。区带电泳区带电泳分类：分类：按支持物物理性状分类按支持物物理性状分类 1. 1. 滤纸及其他纤维素膜电泳。滤纸及其他纤维素膜电泳。 2. 2. 粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。 3. 3. 凝胶电泳凝胶电泳，如琼脂糖、淀粉胶、，如琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4. 4. 丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。按支持物的装置形

5、式不同分类按支持物的装置形式不同分类 1. 1. 平板式电泳平板式电泳2.2. 垂直板式电泳。垂直板式电泳。3. 3. 连续流动电泳连续流动电泳按按pHpH的连续性不同分类的连续性不同分类1. 1. 连续连续pHpH电泳：电泳全部过程中缓冲液电泳：电泳全部过程中缓冲液pHpH保持不变。保持不变。 2 2、不连续、不连续pHpH电泳电泳电泳技术的分类5凝胶电泳技术琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有几乎所有蛋白质蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间

6、的聚集，最常用的就是其相互间的聚集，最常用的就是SDSPAGE电泳技术电泳技术SDSPAGE电泳可用电泳可用圆圆盘盘和和垂直平板电泳的形式，原理相同，垂直平板电泳的形式，原理相同，步骤也大致相同。步骤也大致相同。SDSPAGE电泳亦分为不连续系统和连续系统。电泳亦分为不连续系统和连续系统。本实验采用垂直平板以不连续系统的本实验采用垂直平板以不连续系统的SDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶方式进行电泳。方式进行电泳。垂直平板电泳的优点在于在一块凝胶平板上可以同时进行不垂直平板电泳的优点在于在一块凝胶平板上可以同时进行不同样品的电泳。因此条件一致，更加便于比较。同样品的电泳。因此条件一致，更加便于比

7、较。6二、二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresispolyacrylamide gel electrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳这种凝胶由丙烯酰胺（这种凝胶由丙烯酰胺（acrylamideacrylamide，简称，简称AcrAcr）和交联剂）和交联剂N N，N-N-甲叉基（亚甲基）双丙烯酰胺（甲叉基（亚甲基）双丙烯酰胺（N N，N-methylene-bis-N-methylene-bis-acrylamideac

8、rylamide，简称，简称Bis)Bis)聚合而成。聚合而成。PAGEPAGE电泳是根据蛋白质分子（或其它生物大分子）所带电荷的差电泳是根据蛋白质分子（或其它生物大分子）所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带。异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带。聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，弹性大，透明，化学稳定性高，聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，弹性大，透明，化学稳定性高，无电渗作用，设备简单，用样量少（无电渗作用，设备简单，用样量少（1-100g1-100g）和分辨率高等优）和分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大点，并可通过

9、控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成孔径大小不同的凝胶，可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量小不同的凝胶，可用于蛋白质、核酸等物质的分离、定性和定量分析。还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠（分析。还可结合去垢剂十二烷基硫酸钠（SDSSDS），以测定蛋白质亚），以测定蛋白质亚基分子量。基分子量。7三、三、实验原理实验原理1 1、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种、带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。现象称为电泳。2、蛋白质分子是两性电解质，蛋白质分子是两性电解质，pHpI时该蛋白质带负电时该蛋白质带负电荷，反之荷，反之pHpI时该蛋白质带正电荷。时该蛋白质带

10、正电荷。3 3、SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进中引进SDSSDS（十二烷基磺酸钠），（十二烷基磺酸钠）， SDS SDS能断裂分子内和分能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的有强还原剂的SDSSDS溶液中，与溶液中，与SDSSDS分子按比例结合，形成分子按比例结合，形成带负电荷的带负电荷的SDS-SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大蛋

11、白质复合物，这种复合物由于结合大量的量的SDSSDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDSSDS与蛋白质的与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。子的迁移速度取决于分子大小。8三、三、实验原理实验原理 4. 4. 当蛋白质的分子量在当蛋白质的分子量在150001500020000020

12、0000之间时，之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程：下列方程： 1gMr = 1gMr =K KbmRbmR 式中：式中：MrMr为蛋白质的分子量；为蛋白质的分子量；K K为常数；为常数；b b为斜率；为斜率；mRmR为相对迁移率。在条件一定时，为相对迁移率。在条件一定时，b b和和K K均为常数。均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即在相同条件下

13、进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。可在标准曲线上求得分子量。95 5、聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提、聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；与促凝剂及环境密切相关；6 6、TEMEDTEMED与与APAP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；APAP中含有中含有2929的丙烯酰胺和的丙烯酰胺和1 1的甲叉基聚丙烯酰胺，能的甲叉基聚丙烯酰胺，能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。7 7、十二烷基

14、硫酸钠（、十二烷基硫酸钠（SDSSDS）：阳离子去污剂，作用）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。三、三、实验原理实验原理AP是是过硫酸铵过硫酸铵10夹心垂直板电泳槽示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 1112四、四、仪器、原料和试剂仪器：垂直板型电泳槽；天平；直流稳压电源；仪器：垂直板型电泳槽；天平；直流稳压电源；5050或或100l100l微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；

15、烧杯；微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽；烧杯；吸量管；常头滴管等。吸量管；常头滴管等。原料：原料：SHMTSHMT标准蛋白质按照每种蛋白标准蛋白质按照每种蛋白0.51mgml-10.51mgml-1样样品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成品溶解液配制。可配制成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。混合蛋白质标准液。试剂：试剂： （1 1）分离胶缓冲液（）分离胶缓冲液（Tris-HClTris-HCl缓冲液缓冲液 PH8.9 PH8.9）: :取取1mol/L1mol/L盐酸盐酸48mL48mL，Tris 36.3g,Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容用无离子水溶解后

16、定容至至100mL100mL。 （2 2）浓缩胶缓冲液（）浓缩胶缓冲液（Tris-HClTris-HCl缓冲液缓冲液 PH6.7 PH6.7）: :取取1mol/L1mol/L盐酸盐酸48mL, Tris 5.98g,48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容用无离子水溶解后定容至至100mL100mL。 （3 3）30%30%分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙分离胶贮液：配制方法与连续体系相同，称丙烯酰胺（烯酰胺（AcrAcr） 30g30g及及N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（BisBis）0.8g0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至，溶于重蒸水中，最后定容至

17、100ml100ml，过滤后置棕色，过滤后置棕色试剂瓶中，试剂瓶中，44保存。保存。 （4 4）10%10%浓缩胶贮液：称浓缩胶贮液：称Acr 10gAcr 10g及及Bis 0.5gBis 0.5g，溶于重，溶于重蒸水中，最后定容至蒸水中，最后定容至100mL100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，过滤后置棕色试剂瓶中，44贮存。贮存。 （5 5）10%SDS10%SDS溶液：溶液：SDSSDS在低温易析出结晶，用前微热，在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。使其完全溶解。 （6 6）1%TEMED1%TEMED；13四、四、仪器、原料和试剂 （7 7）10%10%过硫酸铵（过硫酸铵（APAP

18、）：现用现配。）：现用现配。 （8 8）电泳缓冲液（）电泳缓冲液（Tris-Tris-甘氨酸缓冲液甘氨酸缓冲液PH8.3PH8.3）: :称取称取Tris 6.0g, Tris 6.0g, 甘氨酸甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 28.8g, SDS 1.0g, 用无用无离子水溶解后定容至离子水溶解后定容至1L1L。（9 9）样品溶解液：取）样品溶解液：取SDS 100mgSDS 100mg，巯基乙醇，巯基乙醇0.1mL0.1mL，甘油甘油1mL1mL，溴酚蓝，溴酚蓝2mg2mg，0.2mol/L0.2mol/L，pH7.2pH7.2磷酸缓磷酸缓冲液冲液0.5mL0.5mL，加重蒸水至，

19、加重蒸水至10mL10mL（遇液体样品浓度增（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。（1010）染色液：）染色液：0.25g0.25g考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250G-250，加入，加入454mL 50%454mL 50%甲醇溶液和甲醇溶液和46mL46mL冰乙酸即可。冰乙酸即可。（1111）脱色液：）脱色液：75mL75mL冰乙酸，冰乙酸，875mL875mL重蒸水与重蒸水与50mL50mL甲醇混匀。甲醇混匀。14四、四、仪器、原料和试剂五、实验步骤15安装电泳槽安装电泳槽凝胶制备凝胶制备样品处理与加样样品处理与加样电泳电泳剥

20、胶与固定剥胶与固定染色与脱色染色与脱色五、实验步骤1 1、安装夹心式垂直板电泳槽：安装前，胶条、玻板、槽子都要、安装夹心式垂直板电泳槽：安装前，胶条、玻板、槽子都要洁净干燥；洁净干燥；装上贮槽和固定螺丝钉，仰放在桌面上。装上贮槽和固定螺丝钉，仰放在桌面上。将长、短玻璃板分别插到硅橡胶框的凹形槽中，勿用手接触将长、短玻璃板分别插到硅橡胶框的凹形槽中，勿用手接触灌胶面的玻璃。灌胶面的玻璃。将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。上贮槽。将下贮槽的销孔对准以装好螺丝钉的上贮槽，双手以对角线将下贮槽的销孔对准以装好螺丝钉的上贮槽，

21、双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。的方式旋紧螺丝帽。竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的已融化的1%1%琼脂，以封住空隙，加琼脂溶液时，应防止气泡琼脂，以封住空隙，加琼脂溶液时，应防止气泡进入。进入。161718 3 3制备凝胶板：制备凝胶板：（1 1）分离胶制备：按表配制）分离胶制备：按表配制20ml 10%20ml 10%分离胶，混匀后用细分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm8cm高，用高，用1ml1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓

22、慢注注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约入，约34mm34mm高，以进行水封。约高，以进行水封。约30min30min后，凝胶与水封后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。（2 2）浓缩胶的制备：按表配制）浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%10ml 3%浓缩胶，混匀后用细浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约玻璃板上缘约0.5cm0.5cm

23、处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约避免带入气泡。约30min30min后凝胶聚合，再放置后凝胶聚合，再放置2030min2030min。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入上、甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约下贮槽中，应没过短板约0.5cm0.5cm以上，即可准备加样。以上，即可准备加样。 19 4 4样品处理及加样样品处理及加样 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使

24、各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为浓度为0.51mg/mL0.51mg/mL，沸水浴加热，沸水浴加热3 3分钟，冷却至室分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热应在沸水浴中加热1 1分钟，以消除亚稳态聚合。分钟，以消除亚稳态聚合。一般加样体积为一般加样体积为101015L15L（即（即2 210g10g蛋白质）。蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都

25、加了样品，即可开始电泳。待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。20 5 5电泳电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA10mA。待样品进入分离较时，将电流调至。待样品进入分离较时，将电流调至202030 30 mAmA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。为标记，将胶板移至大培养皿中染色

26、。 6 6染色及脱色染色及脱色 将染色液倒入培养皿中，染色将染色液倒入培养皿中，染色1h1h左右，用蒸馏水左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。21大分子大分子小小分分子子缓冲液缓冲液小分子走在前头，大分子滞后小分子走在前头，大分子滞后2223结果分析结果分析24 相对迁移率相对迁移率mR =mR =样品迁移距离（样品迁移距离（cmcm）/ /染料染料迁移距离（迁移距离（cmcm）计算计算25知识补充知识补充SDS-PAGESDS-PAGE电泳过程中影

27、响结果的因素：电泳过程中影响结果的因素：1. 1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在在SDSSDSPAGEPAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是TrisTrisHCLHCL缓冲系统，浓缩胶是缓冲系统，浓缩胶是pH6.7pH6.7，分离胶，分离胶pH8.9pH8.9；而电泳缓；而电泳缓冲液使用的冲液使用的TrisTris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pHpH环环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而泳动效率低；而CLCL离子却很高

28、，两者之间形成导电性较低离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中入分离胶后，由于胶中pHpH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子

29、根据其固有的胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。带电性和分子大小进行分离。 所以，所以，pHpH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。虑该因素。 26 2. 2. 样品如何处理？样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDSSDS处理、非还原处理、非还原SDSSDS处理、带有烷基化作用的还原处理、带有烷基化作用的还原SDSSDS处理。

30、处理。 1 1）还原）还原SDSSDS处理：在上样处理：在上样bufferbuffer中加入中加入SDSSDS和和DTTDTT（或（或BetaBeta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDSSDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样入上样BufferBuffer，离心，沸水煮，离心，沸水煮5min5min，再离心加样。，再离心加样。 2 2）带有烷基化作用的还原）带有烷基化

31、作用的还原SDSSDS处理：碘乙酸胺的烷基化作处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护用可以很好的并经久牢固的保护SHSH基团，得到较窄的谱带；基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的另碘乙酸胺可捕集过量的DTTDTT，而防止银染时的纹理现象。，而防止银染时的纹理现象。100ul100ul样品缓冲液中样品缓冲液中10ul 2010ul 20的碘乙酸胺，并在室温保温的碘乙酸胺，并在室温保温30min30min。 27 3. SDS-PAGE3. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，聚丙烯酰胺的

32、作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7pH6.7，分离胶选择，分离胶选择pH8.9pH8.9，选择，选择tristrisHCLHCL系统，系统，TEMEDTEMED与与APAP：APAP提供自由基，提供自由基，TEMEDTEMED是催是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDSSDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解）：阳离子去污剂，作用有四：

33、去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。肽折叠。 4. 4. 提高提高SDS-PAGESDS-PAGE电泳分辨率的途径？电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或即配即用或4 4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致可导致SDSSDS结晶。一般凝胶可在室温下保存结晶。一般凝胶可在

34、室温下保存4 4天，天，SDSSDS可水可水解聚丙烯酰胺。解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法同染料又各自不同的染色方法28 5.“ 5.“ 微笑微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6. “6. “皱眉皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？（两边向下中间鼓起）形带

35、原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7. 7. 为什么带出现拖尾现象？为什么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶

36、浓度。浓度。 8. 8. 为什么带出现纹理现象？为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。29 9. 9. 什么是什么是“鬼带鬼带”，如何处理？，如何处理？ “鬼带鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来

37、被解离的蛋白质分子重新折被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在同的免疫学活性，在WBWB反应中可见其能与目标条带对应的反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTTDTT或或BetaBeta巯基巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTAEDTA来阻止还原来阻止还原剂的氧化。剂的氧化。 10. 10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确处理办法：更换正确pHpH值的值的BufferBuffer；降低分离胶的浓度。；降低分离胶的浓度。 11. 11. 为什么电泳