共聚焦（无图）ppt课件

1、-书面实验报告：书面实验报告：1 如何判别共聚焦图片的荧光质量？如何判别共聚焦图片的荧光质量？2 影响共聚焦图像质量的硬件要素有哪些？影响共聚焦图像质量的硬件要素有哪些？请同窗们撰写好实验报告后，下次实习前由请同窗们撰写好实验报告后，下次实习前由各班班长收齐并交给中心担任教学的王教各班班长收齐并交给中心担任教学的王教师处！师处！光电倍增管光电倍增管检测针孔检测针孔光源针孔光源针孔光源光源分色镜分色镜物镜物镜样本样本聚集平面聚集平面评判荧光样品制备能否有胜利，可从以下几个方面考量：评判荧光样品制备能否有胜利，可从以下几个方面考量：1荧光标志反响的特异性和荧光信号定位准确性荧光标志反响的特异性和荧

2、光信号定位准确性2坚持样品的构造形状的完好性和免疫活性坚持样品的构造形状的完好性和免疫活性3荧光信号的呼应准确、灵敏、具有可反复性荧光信号的呼应准确、灵敏、具有可反复性4荧光强度荧光强度5荧光稳定性荧光稳定性6荧光信号的分布的一致性荧光信号的分布的一致性7两种及两种以上荧光信号之间荧光光谱交叉，即串色性两种及两种以上荧光信号之间荧光光谱交叉，即串色性8背景噪声干扰性背景噪声干扰性影响获取图像质量主要的共聚焦参数：影响获取图像质量主要的共聚焦参数：1 1检测针孔检测针孔Detector Pinhole Detector Pinhole 2 2激光功率激光功率(Power) (Power) 3 3

3、声光控制器声光控制器 AOTF-Acousto Optic Tunable Filter) AOTF-Acousto Optic Tunable Filter)4 4光电倍增管增益及静噪控制光电倍增管增益及静噪控制PMT Gain & PMT OffsetPMT Gain & PMT Offset5 5反复扫描反复扫描- -数字减噪数字减噪Li.A.Li.A.、Aver.Aver. 6 6扫描图分辨率扫描图分辨率FormatFormat: : 除此以外除此以外 物镜物镜ObjectiveObjective、 扫描速度扫描速度Scan SpeedScan Speed 扫描方向扫描

4、方向Unidirectional Scan / Bidirectional ScanUnidirectional Scan / Bidirectional Scan (X-Direction) (X-Direction) 数码放大数码放大Zoom InZoom In Pin=0.2Pin=1Pin=2025502550255Li.A=0Li.A=0Aver=0Aver=0Li.A=0Li.A=0Aver=0Aver=0Li.A=2Li.A=2Aver=2Aver=2Li.A=2Li.A=2Aver=0Aver=0SpeedZoom1X2X4X8X16X32X64Xothers二二 固定组织时应

5、留意固定组织时应留意 :应力求坚持组织新颖，勿使其枯燥，尽快固定处置；应力求坚持组织新颖，勿使其枯燥，尽快固定处置；组织块不宜过大过厚，必需小于组织块不宜过大过厚，必需小于2cmXl.5cmx0.3cm，尤，尤其是组织块厚度必需控制在其是组织块厚度必需控制在0.3cm以内；以内；固定液必需有足够的量，在体积上普通大于组织固定液必需有足够的量，在体积上普通大于组织20倍以上，倍以上，否那么组织中心固定不良影响效果；否那么组织中心固定不良影响效果；组织固定后应充分水洗。组织固定后应充分水洗。 三薄片样本三薄片样本Thin Samples对于单层培育的细胞，组织切片等较薄的样品，主要是对于单层培育的

6、细胞，组织切片等较薄的样品，主要是获取高分辨率的图像，由于介质薄，因此折射系数的匹配问获取高分辨率的图像，由于介质薄，因此折射系数的匹配问题不像厚样品那么重要，故此可以用甘油作为介质的物镜题不像厚样品那么重要，故此可以用甘油作为介质的物镜63XGlyc、100XOil。四厚片样本四厚片样本Thick Samples对于厚样本对于厚样本202mm在运用中应留意：在运用中应留意：盖玻片要贴紧样本，不要留有空隙，以免任务间隔不够产生盖玻片要贴紧样本，不要留有空隙，以免任务间隔不够产生象差；象差；采用任务间隔足够长的物镜采用任务间隔足够长的物镜10X、20X或或40X，不可以，不可以用油镜，油镜的任务

7、间隔短，会顶破盖玻片，损坏样本，用油镜，油镜的任务间隔短，会顶破盖玻片，损坏样本，甚至物镜，且成像也不明晰；甚至物镜，且成像也不明晰；进展断层成像会有荧光损失，从而影响图像的质量，采取提进展断层成像会有荧光损失，从而影响图像的质量，采取提高检测针孔高检测针孔Pinhole1(AU),添加激光穿透性；添加激光穿透性；在进展在进展“Continuous扫描时，找到最亮的层面进展调焦调扫描时，找到最亮的层面进展调焦调整相应参数。整相应参数。五玻片处置和涂胶五玻片处置和涂胶 对易呵斥细胞、组织脱片的问题采取以下两措施，可防止对易呵斥细胞、组织脱片的问题采取以下两措施，可防止脱片景象出现。脱片景象出现。

8、 1载玻片和盖玻片处置新载玻片上有油污，必需经过清洁载玻片和盖玻片处置新载玻片上有油污，必需经过清洁液浸泡液浸泡1224h，流水充分漂洗后用蒸馏水清洗，流水充分漂洗后用蒸馏水清洗5遍以上，浸遍以上，浸泡在泡在95酒精内酒精内2h，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干均可，用绸布擦干或用红外线烤箱烤干均可，贮放于玻片盒内备用。盖玻片很薄，以上处置程序必需缩短，贮放于玻片盒内备用。盖玻片很薄，以上处置程序必需缩短，清洁液浸泡只需清洁液浸泡只需2h，流水冲洗留意勿损伤玻片等。不主张用，流水冲洗留意勿损伤玻片等。不主张用烘烤箱枯燥。烘烤箱枯燥。 2.载玻片上涂多聚赖氨酸液粘附剂；载玻片上涂多聚赖氨酸液粘附剂；

9、六自发荧光六自发荧光Autofluorescence首先看它时什么颜色？在何部位，与靶区有何关联？能否首先看它时什么颜色？在何部位，与靶区有何关联？能否是杂质？所选择的荧光染料与之必需不同；是杂质？所选择的荧光染料与之必需不同；亮度如何？假设太亮需求避开、减弱；亮度如何？假设太亮需求避开、减弱；能否需求它？通常情况下，有助于确定染色区的定位；能否需求它？通常情况下，有助于确定染色区的定位；来源何处？叶绿体、卵黄、胶原蛋白、还是其他的来源？来源何处？叶绿体、卵黄、胶原蛋白、还是其他的来源？淬灭、漂白；淬灭、漂白；苏丹黑可以淬灭脂质的自发荧光；苏丹黑可以淬灭脂质的自发荧光；组织内的自发荧光可以被硼氢化钠淬灭。组织内的自发荧光可以被硼氢化钠淬灭。组织自发荧光淬灭剂组织自发荧光淬灭剂 AutoFluo Quencher AutoFluo Quencher 1 1、固定：、固定：2 2、能否需求切片？、能否需求切片？ 激发的穿透力为激发的穿透力为50-500um50-500um 取决于荧光探针对组织的浸透才干。取决于荧光探针对组织的浸透才干。 免疫荧光标志的样本：用震荡切片机切厚片免疫荧光标志的样本：用震荡切片机切厚片3 3、透明、透明 酒精脱水酒精脱水 二甲苯透明二甲苯透明 二甲苯二甲苯+ +少量中性树胶湿封少量中性树胶湿封4 4