聚合酶链反应技术分析家蝇抗性基因的研究

1、    聚合酶链反应技术分析家蝇抗性基因的研究*        摘要目的：家蝇对拟除虫菊酯抗药性与细胞色素 P450的CYP6D1基因有关，采用分子生物学的特异性基因聚合酶链反应技术分析家蝇抗药性的发生、发展规律，探讨早期预测及防治策略。方法：提取雄性家蝇腹部DNA作为反应模板，根据CYP6D1基因序列设计特异性基因引物，进行30个循环扩增，电泳分析扩增产物与生物测试结果比较。结果：D-R品系扩增阳性率100%，敏感品系扩增阳性率为0，深圳、汕头、韶关、广州、茂名品系扩增阳性

2、率分别为59%、56.3%、54%、55%及25%。扩增阳性率与家蝇对拟除虫菊酯抗性倍数呈正相关(r0.8344，P0.05)。结论：聚合酶链反应技术应用于家蝇抗性发生、发展规律分析，早期诊断及抗药性发生机理研究有重要意义。关键词聚合酶链反应细胞色素 P450抗药性基因家蝇 Study on a Polymerase Chain Reaction (PCR) Analysing the Insecticide Resistance in the Housefly,Musca domesticaLin LifengZhang ZihongLiu Liping(Health and Anti-Ep

3、idemic Station of Guangdong Province,Guangzhou,510300 )AbstractA cytochrome P450 is responsible for pyrethroid resistance in the housefly. A PCR was used for measuring the relativity between the amplificative frequency of specific resistant alleles in Musca domestica and the pyrethroid resistance ra

4、tio. The results showed that the positive rate of amplification of specific resistant alleles were 100%,0,59%,56.3%,54%,55% and 25% in the deltamethrin resistant strain, susceptible strain, Shenzhen,Shantou,Shaoguan,Guangzhou,Maoming strains respectively. There was positive relativity between the am

5、plificative frequency of individual housefly and resistance ratio to deltamethrin.Key wordsPolymerase chain reactionCytochrome P450ResistanceGeneHousefly掌握卫生害虫自然群体中抗性水平对预测抗性发展、制订控制措施有重要意义。抗性测定常用生物测定法，从整体水平测定抗药性，广为应用的也有生化方法测定酶活性、分子生物学方法测定抗性基因分析抗药性发展趋势等1-2。家蝇对拟除虫菊酯抗药性与细胞色素P450单氧化酶有关，特别是与P450的特异基因CYP6D

6、1变异有关3。本实验首次应用聚合酶链反应(PCR)技术检测广东省家蝇特异抗性基因出现频率，从分子生物学水平探讨分析家蝇抗药性的发生发展规律。1材料与方法1.1家蝇来源抗溴氰菊酯品系(D-R)家蝇、敏感品系(S)家蝇，均为本站昆虫室培养品系；还有深圳、茂名、韶关、广州及汕头品系(SZ、MM、SG、GZ及ST)家蝇。同批家蝇雌虫用于生物测定，雄虫用液氮冷冻保存备用。1.2生物测定自动微量点滴法4。1.3特异抗性基因的聚合酶链反应(SPCR)1.3.1家蝇DNA模板制备参照基因公司的QIAamp组织试剂盒提纯DNA方法5：(1)家蝇组织溶解：取液氮保存的雄蝇腹部置于1.5ml离心管，加180l AT

7、L液匀浆，再加20l蛋白酶K，摇匀，55培养至组织溶解，加入20l RNaseA(20g/l)室温培养2min，加200l AL缓冲液，70培养10min；(2)DNA固定结合：加210l 98%酒精到上述培养液，混匀后加到QIAamp管(置于2ml收集管内)，8 000rpm离心1min；(3)冲洗：用500l Aw缓冲液冲洗QIAamp管2次；(4)DNA洗出：将70预热的200l AE缓冲液加入QIAamp管(置于2ml收集管内)，70培养5min，8 000rpm离心1min，连续冲洗2次。洗出液为DNA模板，保存备用。1.3.2PCR反应(1)引物设计参照N.Liu和T.Tomita

8、6根据抗拟除虫菊酯家蝇的CYP6D1基因序列设计的3个引物，委托上海生工生物工程公司合成。引物1：5-CACAAAATGACCGGCAACTA-3非特异性基因；引物2：5-ACATTGTCGACTTCTTTGGG-3；引物3：5-ACGGCCATTTGGCCTGGTTA-3特异性基因。引物1，2所含的序列为830bp，引物2，3所含的序列为580bp，使用前配成10pmol/l。(2)扩增在0.5ml Eppendoff管中终浓度为10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.2m引物1和2或引物2和3，0.2mM的各种dNTP及1.5U的Taq聚合酶(上

9、海生工产品)。加入3l DNA模板，加双蒸去离子水至终体积为25l。混匀后加入20l石蜡油，离心10s，分层。在基因扩增仪(PE480，美国)自动扩增反应。反应参数：95预变性2min，再进行30个循环：95×45s、55×45s、67×45s、72×45s，最后一个循环72延伸7min。1.3.3扩增产物电泳及检查取10l扩增产物加2l 6倍加样缓冲液(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖水)，加到2%琼脂糖凝胶(含0.5g/ml的溴化乙锭)电泳，并加入Bio-Rad低分子量标准DNA(上海生工提供)对照，电泳结果在紫外光灯检测并摄影。

10、2结果2.1家蝇对溴氰菊酯的抗药性结果见表1。表1家蝇对溴氰菊酯的抗药性种群检查虫数(只)LD50(g/虫)RRS480 0.00201D-R4802.0001000.00MM4800.01115.55GZ4800.01527.60SG4800.01849.22ST4800.021510.80SZ4800.034617.302.2家蝇CYP6D1基因的扩增结果见表2及14。 1S品系家蝇基因PCR扩增结果a、e、b、f、c、g、d、h分别是同一家蝇各用引物1/2及2/3扩增结果；M：Bio-Rad低分子量标准DNA；下同2D-R品系家蝇基因PCR扩增结果3茂名品系家蝇基因PCR扩增结果4深圳品

11、系家蝇基因PCR扩增结果表2家蝇CYP6D1基因的扩增结果种群非特异性基因抗性特异性基因检查只数阳性只数阳性率(%)检查只数阳性只数阳性率(%)S201050.02000.0D-R302583.33030100.0MM24937.524625.0GZ201785.0201155.0SG241875.0241354.0ST322681.3321856.3SZ342882.4342059.0茂名种群特异性基因的扩增阳性率比广州、韶关、汕头、深圳种群的低(23.84，P0.05)，广州、韶关、汕头、深圳种群的扩增阳性率差异无显著性(23.84，P0.05)。特异性基因的扩增比非特异性基因强(14)。

12、2.3家蝇抗性与PCR扩增阳性率的关系见表3。 表3家蝇抗性与PCR扩增阳性率的关系种群对溴氰菊酯的抗性倍数特异性基因阳性率(%)非特异性基因阳性率(%)S1.000.050.0MM5.5525.037.5GZ7.6055.085.0SG9.2254.075.0ST10.856.381.3SZ17.359.082.43讨论 家蝇CYP6D1基因位于第1染色体6，当家蝇对拟除虫菊酯产生抗性，在cDNA第270点位的核苷酸T变为A3，根据这一特点，将变异点作3-末端设计引物2、3(含580bp)的特异性抗性基因，另用非特异性基因含830bp为对照比较。结果：特异性抗性基因引物产生的扩增特异性强，抗

13、溴氰菊酯品系，扩增阳性率达100%。敏感品系家蝇由于不存在抗性基因，因此没有出现扩增。非特异性基因引物(1、3)扩增的阳性率差异不大。抗性倍数与特异性基因阳性率(%)的相关性检验：r0.8344(v4)，呈显著正相关(P0.05)抗性倍数与非特异性基因阳性率(%)的相关性检验：r0.6854(v4)，无相关性(P0.05)本技术应用于现场监测，深圳、汕头、韶关、广州、茂名株的特异性基因扩增阳性率随着其敏感性的增高而下降，与对菊酯类的抗性倍数呈正相关关系，r0.8344(P0.05)。非特异性基因的扩增阳性率与抗性倍数无显著相关性，r0.6854(P0.05)，说明特异性基因的PCR监测能从分子

14、学水平检测蝇类抗性水平。本研究发现家蝇的抗性基因出现频率大于50%时，家蝇已产生明显的抗药性。当扩增阳性率为25%、抗性倍数是5.5倍时，应用PCR技术能有效、早期发现家蝇抗性发生。非特异性基因引物1，2扩增阳性率理论应该是100%，但可能由于合成片段(含830bp)比特异性基因扩增片段(含580bp)较长，不易合成的缘故，所以扩增结果明显较弱，此现象与张玲敏的研究结果相似7。特异基因PCR技术应用，可进一步通过研究，在实验室培养家蝇，观察第几代次施药后家蝇出现特异性抗性基因、抗性基因的发生频率以及停药后培养几代抗性基因频率出现下降，甚至消失；亦可通过交替用药或混配施药方法培养家蝇抗药性，研究

15、交替用药的频度，可以延缓抗性基因产生，这对指导蝇类以及卫生害虫防制、合理用药具有现实意义。已发现家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性与细胞色素P450单加氧化酶的多个基因有关，其中CYP6D1是一重要的控制基因。本研究发现该基因突变频率与抗药性密切相关。通过PCR技术，分析各有关的抗性基因在家蝇产生抗性中所处的地位，对于了解抗性发生机制及对于抗性从分子学水平治理有深远意义。(本课题承蒙中科院动物研究所冯国蕾研究员等指导及本站流研所、寄研所的支持，一并致谢)* 广东省重大科研项目基金及医药卫生科研基金资助课题作者单位：广东省卫生防疫站(广州 510300)参考文献1李月明，孙耘芹，龚坤元，等.乙酰胆碱酯酶敏感性的变化与家蝇抗药性的关系.昆虫学报，1987，30(3)139-245.2Dmitri Ardreev.A PCR Diagnostic for Cyclodiene Inseticide Resistance in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum. Pestic.sci,1994,41345-349.3Tomlta T and Scott JG.Insect Biochem.Molec.Biol.,1994.4张紫