重复经颅磁刺激对阿尔茨海默病学习记忆功能的预保护研究_图文

1、重复经颅磁刺激对阿尔茨海默病学习记忆功能的预 保护研究陶华英 1,田心 2*1天津医科大学总医院神经病学研究所神经生理室,天津(3000522天津医科大学生物医学工程系,天津 (300070E-mail :摘 要:重复经颅磁刺激 (repetitive transcranial magnetic stimulation, rTMS可对有记忆主诉者 的脑认知功能产生积极的影响 22。本文针对经颅磁刺激的神经保护作用,将其用于 AD 的保 护性干预,通过 Morris 行为学检测及电镜下形态学观察在进行 AD 造模之前,预先给予大鼠 rTMS 对 AD 学习记忆功能的预保护作用。结果显示预先施加低

2、频 (LFrTMS-AD及高频 (HFrTMS-AD rTMS组、直接造模组(AD 较对照组 Morris 水迷宫行为测试的全时程及末 2天平均逃避潜伏期显著均延长; 在平台象限的游泳时间和路程占总游泳时间和总路程的百分 比均明显下降;这一结果在 AD 组更为显著,与两个 rTMS 干预组均存在统计学差异;而 LFrTMS-AD 组较 HFrTMS-AD 组潜伏期短,百分比值高 (P<0.05。电镜下 AD 组海马 CA3区神 经细胞突起肿胀,线粒体肿胀嵴消失,突触结构扭曲变形; rTMS 干预组神经细胞结构大致 完整,突触形态结构稍有改变或基本正常。上述结果说明:1. 预先施加 rTM

3、S 能减轻 AD 造 模对神经元及突触形态结构的损伤,对学习记忆功能具有一定的保护作用,且低频 rTMS 较 高频效果更显著; 2. rTMS对 AD 大鼠学习记忆功能保护作用的可能机制是:通过交变磁场 (感 应电流的生物学效应,增高了与学习记忆及神经营养、保护有关的物质(如 BDNF 水平, 进而实现其对神经元、突触结构以及学习记忆功能的保护作用。关键词 :重复经颅磁刺激;阿尔茨海默病; Morris 水迷宫; 淀粉样蛋白;鹅膏酸;预保护; 学习记忆阿尔茨海默病, ( Alzheimers Disease , AD , 是人类老年期最常见的中枢神经系统 原发性退行性病症之一。 我国六十岁以上

4、人 群患病率为 3-5%, 85岁以上为 40-60%, 估计我国现有 700-800万 AD 患者,这一数 字还将随人口老化程度增加而增长。 该病起 病隐匿,早期可能仅有记忆困难或轻度健 忘, 往往难以及早察觉。 当病人逐渐出现记 忆障碍 (近记忆及记忆保持障碍为主 、 认 知功能障碍、 行为异常和社交障碍时, 往往 病情进行性加重,通常在 2-3年内丧失独立 生活能力,并常因并发症而死亡。当前对 AD 尚缺乏有效的防治手段和 客观的特异性早期诊断的生物学标志 , 对 于 AD 的治疗只限于延缓发病和疾病进展, 因此对 AD 的防治已成为 21世纪医学研究 的热点和难点, 寻找有效、 费用低

5、廉且易于 实现的预防方法具有重要社会意义。近十年来,作为一种非侵入性、无痛、 易行的刺激方法, 日益成为神经科疾病的临 床诊断治疗和研究的新途径。 rTMS 已被应 用到神经科学的许多研究领域, 如大脑感觉 和运动传导通路的研究、学习和记忆的研 究、 认知和语言功能的定位研究等, 并对脑 血管病、 帕金森氏病、 偏头痛和多种心理疾 患取得了较好的临床治疗疗效。 多项研究表 明在常规临床参数和标准情况下, rTMS 不 但不会引起神经组织损伤和出血, 而且还具 有减轻脑水肿、保护缺血神经元的作用 9,10,11,12。 最新研究还指出 rTMS 可募集参与 记忆编码过程的代偿性神经网络, 因而可

6、对 有记忆主诉者的脑认知功能产生积极的影 响 22。鉴于 AD 最早出现的临床症状即为近 记忆减退, 即使仅有记忆主诉并保持正常认 知水平 , 亦有可能在未来一段时间进展为 AD , 因此在出现典型的 AD 临床症状前, 施 加 rTMS ,有可能对有记忆主诉者的学习记 忆功产生保护作用。 以此为切入点, 本文针 对经颅磁刺激的神经保护作用, 首次将其用 于 AD 的 保 护 性 干 预 , 即 在 造 模 前 给 予rTMS ,以研究 rTMS 对 AD 模型的学习记忆 功能的预保护作用,为 AD 的临床预防提供 实验依据和方法。1.材料与方法1.1 实验动物及分组Sprague-Dawle

7、y (SD 大鼠, 5月龄, 雌雄各半,雌鼠体重 250-350g ,雄鼠体重 350-450g, 由军事科学院实验动物中心提 供(合格证号:0056093。 12h 光照, 12h 黑暗。室温维持在 25±1 。所有涉及动物 的实验均按美国国立卫生研究院(NIH 颁 布的 “ 实验动物的照料和使用指南 ” 的要求 进行。将全部大鼠按体重随机分为 4组,每组 12只, 雌雄各半, 分别为:1. 预先低频 rTMS 组 (LFrTMS-AD; 2. 预 先 高 频 rTMS 组 (HFrTMS-AD; 3. 直接造模组(AD ; 4. 空白对照组。1.2 实验方法预 先 分 别 对 L

8、FrTMS-AD 组 、 HFrTMS-AD 组大鼠施加低频及高频 rTMs 后 (参数见后述 ,采用脑内立体定位,双侧 NBM 核联合注射 A 和鹅膏酸 (Ibo 的方法, 对 rTMS 干预组及 AD 组大鼠进行 AD 造模, 并分别进行大鼠学习记忆功能测试及形态 学检测。1.2.1 AD模型大鼠的制备大鼠用乌拉坦腹腔注射 (33mg/Kg体重 麻醉后, 置于脑立体定位仪上, 定位脑 NBM 核, 位点为 Bregma 点向后 1.8mm ; 正中旁开 2.8mm ;硬脑膜下 7.0mm 。采用微型电钻, 左右对称各钻一孔(直径 0.8mm , 由微注 射泵每侧分别注射 A 1-40 4&

9、#181;l(含 A 1-404µg, 已在 37 孵育 1周 及 Ibo 1µl(含 Ibo 1µg, 20min 内注射完毕,留针 10min 。术后常规 饲养, 对出现惊厥者给予少量安定 (肌肉注 射,视体温情况给予抗生素。 1.2.2 AD模型大鼠的 Morris 水迷宫行为学 检测各组大鼠均在购入后,经 10天适应性 饲养,开始进行初次 Morris 水迷宫测试。于 造模术后 3周,各组大鼠再次进行 Morris 水 迷宫测试。 包括定位航行实验和空间搜索试 验。定位航行实验:历时 4天, 第 1天大鼠自 由游泳 2min (随机点入水 , 无平台,从第

10、 2天起,每天分为两个训练时段(间隔大于 8小时,每个训练时段训练 4次,每次均由 不同象限入水, 记录大鼠寻找并爬上平台所 需时间 (即逃避潜伏期 。 本实验设定大鼠在 平台停留时间大于 2秒为找到平台;如果在 120秒内未找到平台,则将其引至平台,使 其停留 20秒,其逃避潜伏期记为 120秒。 空间搜索试验:第 5天撤除平台,大鼠 由 象限入水, 同步记录其 120秒运动轨迹。 计算其在平台所在象限的游泳时间及游泳 路径长度占总游泳时间及总路径长度的百 分比。1.2.3 rTMS的实施方法及参数确定采 用 丹 麦 Meditronic 公 司 Maglite Pro-25型磁刺激器,选用

11、聚焦效果较好的 “8” 字型刺激线圈, 内径 10mm , 外径 80mm, 厚度 60mm 。施加刺激时,将 “8” 字线圈中 心对准清醒大鼠矢状缝的中央点, 线圈表面 紧贴头皮,平行于大鼠顶骨。本文中造模前对 LFrTMS-AD 组采用的 刺激参数为:20个串 /日, 20个 pulse/串,刺 激频率为 1Hz ,连续刺激 5天为一疗程,共 4个疗程, 疗程间隔为 1周; HFrTMS-AD 组刺 激频率为 5Hz , 其他刺激参数同 LFrTMS-AD 组。限于实验条件,本文参照 Luft 等人对大 鼠 rTMS 所测得的运动阈值 14,刺激强度选 定为 0.4-0.5 Tesla。1

12、.3 海马 CA3区超微结构电镜观察的 动物取材随机选取 HFrTMS 组、 LFrTMS 组、直接造模组及空白对照组大鼠各 1只,根据 Pellegrino 大鼠脑立体定位图谱,迅速切取 大鼠海马 CA1及 CA3区脑组织,立即投入 2%戊二醛固定液中(含 3%新鲜多聚甲醛 1%锇酸后固定 1h ,常规乙醇、丙酮脱水、 固定, Epon 8l2包埋, LKB 超薄切片,醋酸 铀、柠檬酸铅双重染色,日立 H-600透射电 镜观察并拍片。1.4 数据统计用 SPSS 统计软件包进行处理,数据以 平均值加减标准差 (±s 表示。采用独立样 本 t 检验对以下各组指标均数进行比较,显 著性

13、水平为 P<0.05.2.结果本课题采用 NBM 核双侧联合微量注射 A 及 Ibo 的造模方法,由预先经过 rTMS 保护性干预的大鼠制备 AD 模型, 并通过行 为学 (Morris 水迷宫 及检测, 与对照组比 较, 对 AD 大鼠模型进行验证的同时, 通过 各组间的比较探索 rTMS 对 AD 认知功能的 保护作用,结果如下:2.1 造模前大鼠 Morris 水迷宫测试 结果SD 大鼠购入后饲养 10日,于造模前, 各组均进行首次 Morris 水迷宫行为学测试。 定位航行试验结果显示, 造模前各组大鼠在 第二天均可出现逃避潜伏期的大幅下降, 以 后逐渐趋于稳定。 为比较大鼠获取

14、信息的能 力, 本文分别计算了各组在训练末 2天内及 全部训练时段的总平均逃避潜伏期, 如图 1所 示 , 各 组 间 差 异 均 无 统 计 学 意 义 (p>0.05 。在空间探索试验中,各组间在 平台所在象限的游泳时间及在原平台象限 游泳路径长度占总路径长度的百分比均差 异均无统计学意义 (p>0.05 , 见图 2所示。 Fig.1 The result of place navigation test before AD model established Fig.2 The result of special probe test before AD model est

15、ablished Fig.3 The latest 2 days average escape latency before and after AD model established2.2造模后 Morris 水迷宫测试结果 (1定位航行试验联合注射 A 与 Ibo 的各造模组大鼠末 2天逃避潜伏期及全时段总平均逃避潜伏 期均较自身造模前及 对照组均不同程度延 长(图 3、图 4 ;其中 AD 组较 rTMS 组更 为显著 (P<0.01。而在两个 rTMS 组中, HFrTMS-AD 组又较 LFrTMS-AD 各潜伏期 长 (P<0.05 。 Fig.4 The whole

16、 average escape latency before andafter AD model established a.marginal b.random c. tendency dstraightFig.5 4 typical traces of movement in spacial probetestFig.6 Swimming time in platform-quadrant beforeand after AD model establishedFig.7 The percentage of swimming distance in platform-quadrant bef

17、ore and after AD established(2空间探索试验经过 4天训练, 第 5天撤去 Morris 水迷宫的平台,各组大鼠均由 I 象限入水,进行空 间探索试验, 游泳时间为 120s 。 各组大鼠搜 索 平 台 的 运 动 策 略 包 括 :直 线 式(straight、趋向式 (tendency、边缘式 (marginal及随机式 (random, 如图 5所示。 其中直接造模组为边缘式及随机式 (大 约各占 50% ; 空白对照组中, 约 70%为直 线式,其它为趋向式; rTMS 组多为随机式 及趋向式。由此可见 AD 模型大鼠的空间记 忆能力受损最为严重, rTMS

18、 组受损程度较 AD 轻。此外, A 与 Ibo 药物注射组的平台所 在象限游泳时间、 在原平台象限游泳路径长 度占总路径长度的百分比均较造模前明显 下降(p<0.01 ,见图 6、图 7;其中以直接 造模组最为显著; 同时, 其在平台所在象限 游泳时间及在原平台象限游泳路径长度占 总路径长度的百分比均较未造模组降低。2.3 各组大鼠海马 CA3区的电镜观察结果 对 LFrTMS-AD 组、 HFrTMS-AD 组、 直接造模组 (AD组 及对照组大鼠海马 CA3区组织进行电镜检测, 从神经元胞体及细胞 器、突触结构,血脑屏障等方面进行观察:在 AD 组大鼠海马 CA3区,可见神经细胞

19、突起肿胀, 线粒体肿胀细胞核皱缩变形, 染 色质聚集成大的团块, 边缘化、 附着核糖体 脱颗粒现象及多聚核糖体解聚,空泡较多。 突触多有肿胀, 结构扭曲不清, 微血管管腔 狭窄,内皮细胞肿胀,参见 Fig.8, Fig.9。 LFrTMS-AD 及 HFrTMS-AD 组突触形态较 好, 结构清晰, 突触前小泡丰富, 突触膜和 突触间隙基本正常, 仅在 HFrTMS-AD 组可 见部分树突轻度肿胀,其内可见少量微管, 多为不整形物质及变性的管腔样结构, 参 见 Fig.10、 Fig.11。 Fig. 8 Marked synaptic alteration (arrow in the CA3

20、hippocampus in AD group (×12,000.Fig. 9 The nucleus alteration and the vacuoles in CA3(arrow hippocampus in AD group (×10,000Fig.10 The quasi-normal synapse and neuron in CA3 hippocampus in LFrTMS-AD group (×12,000Fig.11 The quasi-normal synaptic Morpheus andstructure with light dendr

21、ite intumesce(arrow inCA3 hippocampus in HFrTMS-AD group (×12,000 3. 讨论 AD 动物模型的制备方法有多种。注射 药物采用 A，部位选择海马区的 AD 造模 方法最为常见。不仅如此, 在 AD 临床的早 早期以显著的单纯性记忆损害为特征症状， 大量研究证实这一症状始于海马突触效率 的细微下降， 这种改变先于神经元直接发生 变性， 并且突触的这种功能障碍可能由可播 散的 A 寡聚体引起15。基于此，本文采用 A 作为制备 AD 突触功能及认知功能障碍 模型的药物之一。 鉴于 A 及 Ibo 可导致 NBM 胆碱能大 神

22、经元溃变， 神经核团的面积变小， 从而损 害从 NBM 到新皮层胆碱能投射系统， 大脑 皮层和海马 ChAT 活性和 AChE 活性降低， 大脑皮层和 M 受体结合位点（Rt）下调， 最终导致明显的学习和记忆功能改变,并发 现隔内侧损害产生短期或工作记忆损害， 双 侧损害时还可产生长期记忆损害 23,24 HFrTMS-AD 组更为显著 (P<0.05。以上结 果显示预先给予 rTMS 可对 AD 模型大鼠的 学习记忆功能产生一定的保护作用; 但是 这一保护作用是在一定程度上的， 不能根本 消除 A 及 Ibo 对突触及神经元的毒性作 用。 虽然rTMS对神经保护作用机理尚须探 索，但已

23、有研究证实对正常大鼠施加rTMS 后可在海马区观察到BDNF表达增加，特别 CA 是在海马CA3、 3c区和颗粒细胞层及皮层 内 BDNF mRNA及其蛋白质含量显著增 高，而且BDNF是海马依赖性学习及LTP诱 导的重要组成 19,20并可使二者的功能受损 成为可逆的过程21。 此外，BDNF还对正 常成年大脑中的前脑胆碱能神经元具有神 经营养、 保护和修复作用， 且可调节突触功 能和神经元对外界信号的敏感性。 大量的证 据显示BDNF可阻止动物实验性损伤或与 正常老年有关的胆碱神经元退化， 改善动物 行为缺失。 另有研究报告在对正常大鼠施加 rTMS后，在其脑脊液及其体外海马HT22细 胞

24、培养液距发现分泌性淀粉样蛋白前体 （sAPP）的浓度明显增加，提示了神经保 护作用。sAPP 可由神经元释放出来，具有 神经营养保护机能， 可促进神经元突起和突 触发生作用。由此笔者有理由推测，rTMS 对于AD大鼠认知功能的保护作用的机制可 能是： 通过其磁场的生物学效应， 增强了与 认知及神经营养、保护有关的物质BDNF及 sAPP水平进而实现其对神经元、突触以及 认知功能的保护作用。因此, rTMS 后 BDNF及sAPP在AD模型大鼠海马区的水平 变化值得进行深入研究, 以明确其作用发 作机理。 鉴于外源性 BDNF 不能通过血脑屏障， 只有直接注入脑内才具有神经元保护作用， 所以通过

25、 rTMS 提高脑内与学习记忆密切 相关的海马部位的 BDNF 水平是目前脑内 获取 BDNF 的经济、有效途径，这也可能 正是 rTMS 神经保护作用的主要机制。 由此 笔者认为低频率、 安全强度的 rTMS 可保护 -6- ，故 本研究中采用双侧 NBM 核联合注射 A 及 Ibo 的造模方法对大鼠学习记忆功能造成损 害， 其中长期记忆的损害在本实验中可将再 次进行 Morris 水迷宫时前次测试的残留记 忆对实验结果的影响降至最低， 显示出较为 明显的优越性。 Morris 水迷宫测试结果显示， 造模后预 先 施 加 低 频 (LFrTMS-AD 及 高 频 (HFrTMS-AD rTM

26、S 组、 直接造模组 （AD） 较对照组的全时程及末 2 天平均逃避潜伏 期均显著延长； 在平台所在象限的游泳时间 和路程占总游泳时间和总路程的百分比也 明显下降； 表明在大鼠双侧脑基底 NBM 核 微注射泵联合微量注射 A 和 Ibo 这一造模 方法， 可成功地从行为学上模拟临床 AD 的 学习记忆功能障碍； 而施加磁刺激组较直接 造模组潜伏期更短，百分比值更高；说明 rTMS 无论高频、低频刺激均可在一定程度 上降低大鼠脑部组织对 AD 造模所致损害 的敏感程度,减少对于大鼠的学习记忆功能 的 损 害 ； 并 且 LFrTMS-AD 组 较 神经元和突触功能， 减少内外环境中不良因 素。对

27、其造成的损害目前脑内获取 BDNF 的经济、有效途径，这也可能正是 rTMS 神 经保护作用的主要机制。 由此笔者认为低频 率、 安全强度的 rTMS 可保护神经元和突触 功能， 减少内外环境中不良因素对其造成的 损害。 参考文献 1. 盛树立，主编.老年性痴呆：从分子生物学到 临床诊治 北 京：科学 技术 文献出版社， 1998,216-247。 2. Elias MF, Beiser A, Wolf PA,et al. The preclinical phase of Alzheimer disease: a 22-year prospective study of the Framing

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