酶法提取仙人草黄酮类化合物的研究

1、酶法提取仙人草黄酮类化合物的研究    【摘要】  目的研究纤维素酶对仙人草黄酮提取得率的影响。方法采用纤维素酶酶解预处理合用乙醇水浴加热回流从仙人草中提取总黄酮，以仙人草黄酮类化合物的提取率为指标，考察提取过程中各因素对得率的影响。结果最佳酶解条件为：酶解温度50;酶解时间2.5 h，酶解pH值4.5;酶浓度10 U/ml;酶法辅助提取仙人草黄酮平均得率为1.301%，比传统提取方法提高了9.79%。结论纤维素酶辅助有利于提高仙人草黄酮提取得率。 【关键词】  酶法; 仙人草; 提取; 黄酮类化合物仙人草Mesona chinens

2、is Benth.,又名凉粉草、仙人冻、仙草,为唇形科一年生草本植物。分布于广东、广西、江西、福建、浙江、台湾和云南等地，印度、印度尼西亚和马来西亚等地也有分布1。我国南方几个省区部分地方有田间栽培。据本草求原记载，凉粉草有“清暑热，解热毒,治酒风”的功效，又据岭南采药录中记载，凉粉草可治花柳毒入骨。中医认为，凉粉草性凉寒，味甘淡涩，嚼之有胶性，具有清热利湿、凉血解暑，解渴利水和除热毒之功效。现代医学分析测定认为，凉粉草中的黄酮类物质、熊果酸、齐墩果酸、多糖、微量元素、维生素等各自具备调节和增强生理机能的作用24。临床上凉粉草可治中暑、消渴、高血压病、黄疸、急性肾炎、酒风、淋病等症。仙人草作为

3、中草药和制作凉粉冻的原料在我国已有悠久的历史，并且已经成了我国南方一些地方的出口创汇的农产品。凉粉草有效成分的提取有助于凉粉草进一步开发利用，目前研究较多1, 5，6，但仙人草中的成分被以纤维素为主构成的细胞壁所包围，影响得率。有研究表明酶法辅助可提高植物中有效成分的提取率712。本实验以黄酮类化合物提取率为考察指标，研究酶法辅助提取对仙人草有效成分得率的影响。1 材料仙人草，购买于梅州市梅松路益民百草店，已晒干;纤维素酶，上海伯奥生物科技有限公司，酶活力15 U/mg;芦丁，国药集团化学试剂有限公司，芦丁含量>95.0%;95%食用乙醇;硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为分析纯。2 方法2

4、.1 仙人草材料的处理将仙人草放于干燥箱中60干燥，用粉碎机粉碎成粉末状。2.2 仙人草黄酮类化合物的提取传统的乙醇加热提取方法：根据本实验室实验结果，称量1 g仙人草，用80%乙醇，料液比140(g/ml)，70恒温水浴回流加热提取3 h，回流后过滤，得滤液,将滤液定容至40ml。酶解辅助提取方法：称量1 g仙人草，置于纤维素酶液中，料液比15( g/ml)，使其在一定的酶解条件下反应一定时间;酶解完成后，蒸干酶液，用80%乙醇,料液比140,70恒温水浴回流加热提取3 h;回流后过滤，得滤液，将滤液定容至40 ml。实验平行3次，取平均值。2.3 黄酮类化合物含量测定采用NaNO2-Al(

5、NO3)3-NaOH显色法12，以芦丁为标样测定仙人草总黄酮含量。用50%乙醇配得浓度为0.102 mg/ml的芦丁标准液。准确吸取标准液0.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml，分别置于25 ml容量瓶中，各加50% 乙醇使成15.0 ml，各精密加入5% NaNO2溶液0.3 ml，充分摇匀，放置6 min;精密加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml，充分摇匀，放置6 min;再加1 mol/L NaOH溶液4.0ml，用50% 乙醇稀释至刻度，充分摇匀，放置15 min。以50?乙醇作为空白参比液，用分光光度法，在510 nm波长下测定吸收度A，得到回归曲线方程：C=

6、0.0621A+0.000 3，R2=0.999 5(式中：C，样品的浓度mg/ml;A，吸光度)。准确吸取2 ml提取液替代标准液，按上法提取液的吸光度A，计算样品中的黄酮提取率Q。2.4 最佳酶解条件的确定单因素试验以A(酶解温度)、B(酶解初始pH值)、C(酶解时间)、D(酶浓度)为4个考察因素。正交实验根据单因素试验结果选择采用L16(45)正交表，因素水平表见表1。表1 因素水平3 结果与讨论3.1 酶解条件对仙人草总黄酮提取得率的影响纤维素酶作用于仙人草细胞，使构成细胞壁的纤维素降解为二聚糖、葡萄糖等小分子物质，细胞壁的破裂有利于仙人草黄酮的浸出。各种酶均有最适作用条件，实验考察了

7、酶浓度、酶解温度、酶解pH值、酶解时间对仙人草总黄酮提取得率的影响。酶解温度50，酶解pH值4.5，酶解时间2.5 h，以不同的酶浓度处理。结果见图1。在酶浓度为10 U/ml以下，总黄酮收率随酶浓度的增大而增加，当酶浓度为10 U/ml时，黄酮类化合物的得率为最大值，继续增大酶浓度，提取得率变化不明显。温度升高一般有利于提取。由于酶的活性多在4050较好，因此考察酶解温度为40，45，50，55，60对仙人草黄酮类化合物最终提取得率的影响。酶浓度10 U/ml，酶解pH值4.5，酶解时间2.5 h，以不同的酶解温度进行提取。结果见图2。酶最适作用温度为50，此时最有利于细胞壁分解，使黄酮类化

8、合物更易向溶剂主体的扩散，提高仙人草总黄酮的提取率，以后随酶解温度的进一步升高酶活下降导致得率减少。图1 酶浓度与仙人草黄酮类 图2 酶解温度和黄酮类化合物提取得率的关系 化合物提取得率的关系在酶浓度10 U/ml，酶解pH值4.5，酶解温度50，以不同的酶解时间进行提取。结果见图3。可见酶解时间的长短也将影响酶解效率，时间太短，破壁效果不佳，时间太长一方面将给工作带来一定的困难，而且过长的酶解时间并不能继续提高提取得率，酶解3 h即可达到最佳效果。纤维素酶的活性与pH值密切相关，pH值不仅能够影响酶的构象，也能影响底物的解离状态，从而对酶活力产生影响。纤维素酶的活性在微酸性环境下较好，所以设

9、计pH值分别为4，4.5，5，5.5，6五个pH值水平的实验，考察pH值对黄酮类化合物得率的影响。酶解温度50，酶浓度10 U/ml，酶解时间2.5 h，不同的酶解pH值进行提取，结果见图4，最适pH=4.5。图3 酶解时间和黄酮类 图4 酶解pH值和黄酮类化合物提取得率的关系 化合物提取得率的关系3.2 最适酶解条件的确定由表3可知，最佳酶解条件为酶浓度10 U/mL，酶解温度50，酶解pH值4.5，酶解时间2.5 h，此酶解条件为最优组合。方差分析表明，因素A(酶解温度)、因素C(酶解时间)高度显著，因素D(酶浓度)较显著，因素B(酶解pH值)不显著。表3 L16(45)正交结果表4 方差

10、分析表3.3 加酶提取与传统提取方法的比较从表5可知，加酶处理提取(1组)比未加酶处理提取得率分别提高了9.79%(2组)和9.604%(3组)，酶法辅助提取效果较明显。表5 3种提取方法的结果比较4 结论酶解辅助提取过程分为酶解和乙醇加热回流提取两部分，对酶解过程的影响因素，如酶浓度，酶解温度，酶解pH值，酶解时间逐一考察，并进行正交实验以确定最佳酶解条件的组合。在最佳酶解条件下酶解辅助提取与传统乙醇回流提取进行比较，比较两者的提取得率。本实验建立酶解法与醇提相结合的提取方法，确定了最佳酶解条件为酶浓度10 U/ml，酶解温度50，酶解pH值4.5，酶解时间2.5 h，获得了较好的效果，用酶

11、解预处理后，再用乙醇提取，仙人草黄酮类化合物的得率比直接醇提提高了9.79%，能够有效利用仙人草资源。酶法辅助提取方法用于中草药的提取，操作简便，成本低廉，并具备大生产的可行性。目前，应加强酶处理技术应用于中草药工业生产的研究，推动中药现代化。【参考文献】  1 刘晓庚，陈梅梅. 中国仙草的开发利用研究J. 食品研究与开发， 2004， 25(5): 109.2 杨 敏，冯 磊，柯雪琴，等. 仙草多糖对大鼠肝匀浆脂质过氧化的实验研究J.浙江预防科学， 2002， 14(12):4.3 李建华. 台湾仙草及其栽培利用J. 台湾农业探索， 2000， 12: 37.4 柳占彪，王 鼎，王淑珍，等. 齐墩果酸的降糖作用J. 中国药学杂志， 1994， 29(12):725.5 吴小林， 戴 敏， 关卫兵，等.仙草中提取仙草胶及其胶性能测定J. 中药材， 2008， 31(9): 1421.6 尹怀霞， 黎锡流， 朱良从. 仙草中提取仙草胶的研究J. 现代食品科技，2006， 22(3):134.7 何际婵.浅谈酶法在中草药提取中的应用J.中医药学刊，2005，23(9):1717.8 陈炳华，张其清，谢必峰，等.酶解法对山楂总黄酮提取及含量分析的影响J.福建师范大学学报(自然科学版)，1997，13(4):90.9 丛 伟.酶法提取银杏叶