膀胱移行细胞癌VEGF表达及与血管形成定量的关系

1、    膀胱移行细胞癌VEGF表达及与血管 形成定量的关系        摘要为了探讨膀胱移行细胞癌中血管内皮生长因子(VEGF)表达及其与血管形成定量关系，应用免疫组织化学方法，对62例原发性膀胱移行细胞癌及8例正常膀胱组织中VEGF进行检测，并对其在30例浸润性膀胱癌组织中表达与血管形成定量关系进行了研究。结果发现正常膀胱组织均为阴性反应，膀胱癌组织中VEGF蛋白阳性表达率为56%。低分化和浸润性癌中VEGF蛋白阳性表达率明显高于高分化和表浅性癌组(P0.05)

2、，浸润性膀胱癌组织中血管形成定量与VEGF表达密切相关(P0.01)。结果提示：VEGF表达对膀胱癌生物学行为有重要影响。VEGF是膀胱癌发生发展过程中一个主要血管生成因子，VEGF蛋白表达和血管形成定量有可能成为预测膀胱癌转移和预后的指标。关键词膀胱肿瘤癌血管形成免疫组织化学 Expression of VEGF in transitional cell carcinoma of bladder and its relationship with the quantification of angiogenesisShi Qixing?,Li Fang,Liu Tongcai,et al.D

3、epartment of Urology,463th Hospital of Chinese Air Force,Shenyang 110042AbstractExpression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in 62 cases of primary transitional cell carcinoma (TCC) and 8 cases of normal bladder tissue was assayed using immunohistochemical technique.The relationship betwe

4、en the expression of VEGF in 30 cases of invasive neoplastic tissues and quantification of angiogenesis was also investigated.All normal bladder tissues showed negative staining while the rate of expression of VEGF in neoplastic tissues was 56%.The positive rate of VEGF expression in poorly differen

5、tiated and invasive bladder tumors were higher than those of well differentiated and superficial tumors (P0.05).Expression of VEGF in invasive TCC was correlated with the quantification of angiogensis (P0.01).The results suggest that expression of VEGF has important influence on the biological behav

6、ior of bladder carcinoma,VEGF being a major angiogenic growth factor.VEGF expression and quantification of angiogenesis might serve as an indicator to the metastasis and prognosis of bladder cancinoma.Key wordBladder neoplasmsCarcinomaAngiogenesisImmunohistochemistry血管内皮生长因子(VEGF)是新近确定的一种具有旁分泌机制的血管生

7、成因子，它能特异性作用于血管内皮细胞，刺激其增殖，迁移和诱导血管生成1。我们应用免疫组织化学技术研究VEGF在膀胱癌组织中的表达，并探讨与血管形成定量的关系，以了解VEGF在膀胱癌血管形成中的作用及其生物学意义。材料和方法一、组织标本19891994年间因原发性膀胱癌行手术切除的肿瘤标本62例，男性54例，女性8例。年龄2672岁，平均60.6岁。全部组织取自术前未经任何治疗的手术切除并经病理证实的标本，另选8例正常膀胱组织作为对照。组织均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。按WHO分级标准：级15例，级27例，级20例，均为移行细胞癌。临床分期按UICC标准：TisT1 32例，T2T4 3

8、0例。石蜡标本连续切片，制成5m厚备染。二、实验方法采用免疫组化S-P法。一抗分别为兔抗人VEGF多克隆抗体(Santa Cruz公司产品)，兔抗人第因子相关抗原多克隆抗体和二抗生物素标记羊抗兔IgG及S-P试剂盒(均为Zymed公司产品)。石蜡切片常规脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢孵育10分钟，消除内源性过氧化物酶活性。10%正常山羊血清处理切片15分钟，依次加入一抗，37 1小时，二抗及S-P复合物各15分钟。DAB显色，苏木素复染，逐级脱水，透明封片，光镜观察。用已知肾癌阳性切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照，HE染色进行分级分期。三、结果判定VEGF染色阳性标准为细胞浆染色强

9、度符合(+)且着色细胞数25%；血管形成定量以微血管计数表示。在200×视野下计数5个视野最高数目的微血管，以其平均数表示。镜下呈现棕黄色或棕褐色的内皮细胞或内皮细胞簇被视为可计数的微血管，目前此项技术主要进行浸润性膀胱癌的研究。统计学处理采用2检验和t检验。结果一、VEGF表达及与分级分期的关系8例正常膀胱组织均为阴性反应，62例膀胱癌组织阳性反应35例(56%)。VEGF主要着色部位为癌细胞浆，少数癌细胞周围的小血管内皮细胞着色呈弱阳性。VEGF表达阳性率与病理分级和临床分期的关系见表1。级与级比较P0.05，级与级比较P0.05，级与级比较P0.05；TisT1与T2T4比较P

10、0.05。二、浸润性膀胱癌微血管分布和定量30例浸润性膀胱癌组织中微血管分布呈异质性，微血管定量为62.4±20.5。微血管定量级10例，微血管计数58.3±24.6，级20例，微血管计数71.2±18.6，二者比较，P0.05；T2 18例，微血管计数61.3±23.1，T3T4 12例，微血管计数75.6±15.2，二者比较，P0.05。随着分级和分期增高，微血管计数呈增加趋势，但统计学处理无显著性差异。表1VEGF表达与分级和分期的关系例数阳性例数阳性率(%)15533271659201470TisT1321444T2T4302170&#

11、160;    三、膀胱癌组织VEGF表达与微血管定量的关系在30例浸润性膀胱癌中，VEGF表达阳性者21例(70%)，微血管计数为73.4±14.8，VEGF表达阴性者9例，微血管计数为55.2±10.2，两组相比较有显著性差异(P0.01)。 讨论血管内皮生长因子(VEGF)是1989年Ferrara等2在牛垂体滤泡星状细胞体外培养液中首先分离纯化出来的，根据其促血管内皮细胞有丝分裂的活性而命名为VEGF。它是由两个分子量为23 000亚基以二硫键结合的二聚体糖蛋白。人体内的VEGF由同一基因编码的四种蛋白质，分别含121、165、189和

12、206个氨基酸，基因结构是由交替剪接的8个外显子和7个内含子构成。因同时具有增加血管通透性作用，亦称血管通透性因子(VPF)1。研究表明，VEGF是对血管生长有诱导作用的众多生长因子中，唯一一种以特异的旁分泌方式作用于血管内皮细胞，促进其增殖、迁移及诱导新生血管生成的生长因子。体内实验表明，VEGF可促进瘤体的生长，抑制VEGF活性，明显抑制某些恶性肿瘤的生长，而且抑制作用与肿瘤恶性程度及血管化程度呈正相关3。研究发现，VEGF在生物利用率上可能存在二种调节机制，即在基因水平上多种VEGF的选择性剪接和蛋白水解酶作用的调节性释放，其中和膜结合的部分可看作是暂时的一种贮存形式，当生理或病理条件需

13、要时释放出来4。结果表明：VEGF在与血管内皮细胞增殖相关的生理和病理过程中起着中心调控作用，与实体瘤生长密切相关。目前已在许多恶性肿瘤组织和体外培养的肿瘤细胞株中发现有VEGF mRNA和VEGF蛋白的高表达，如胃癌、结肠癌、乳癌、肾癌和胶质瘤1。Brown等5报道2例浸润性膀胱癌中VEGF mRNA呈高表达，修波等6研究证实膀胱癌组织VEGF mRNA表达较癌旁组织增高。本研究结果显示：VEGF蛋白在正常尿路上皮中不表达，在膀胱癌组织中呈高表达。随着病理级别增高，VEGF蛋白阳性表达率增加，低分化组阳性表达率明显高于高分化组，说明VEGF蛋白在膀胱癌中的表达与膀胱癌的分化程度有关。VEGF

14、阳性表达率越高，膀胱癌细胞分化程度越低，说明VEGF表达水平与肿瘤恶性程度呈正相关。在浸润性膀胱癌组织中的阳性表达率显著高于表浅性膀胱癌，提示VEGF蛋白在膀胱癌组织中的表达可能和膀胱癌细胞的浸润能力有关。VEGF表达率越高，膀胱癌细胞的浸润能力越强。因此，VEGF高表达可能预测膀胱癌的转移或复发，可作为判定膀胱癌预后的一个重要指标。肿瘤对血管形成具有依赖性。血管形成是肿瘤发生和发展的关键。血管形成是一个复杂的过程，包括内皮细胞分裂和迁移，血管基底膜及细胞外基质的选择性降解。研究发现，VEGF通过直接和间接作用对血管生成过程进行调控，从而促进肿瘤血管形成。最近几年的免疫组化研究发现乳癌、肺癌、

15、前列腺癌等肿瘤血管形成的定量与转移、复发和预后密切相关7，8。本研究发现在浸润性膀胱癌组织中随着病理分级和分期增高，微血管计数呈上升趋势，但未获统计学支持，与Dickison等9报道结果一致，类似发现在乳癌和肺癌等研究中也有报道。为了观察VEGF在肿瘤血管生成过程中的作用，Takahashi等10，11研究显示，肾癌VEGF mRNA高表达与其富含血管特性是相关的；结肠癌组织中VEGF蛋白及其受体表达与分期和微血管计数密切相关，可作为预测转移的指标。Samoto等12证实VEGF mRNA在神经胶质瘤中表达与微血管计数呈正相关。说明VEGF在人类实体肿瘤中高表达并与血管形成相关具有普遍性。本结

16、果显示：VEGF蛋白阳性组微血管定量明显高于VEGF阴性组。提示在浸润性膀胱癌中微血管定量与VEGF表达密切相关。据文献报道，培养的内皮细胞能产生第因子前体，而VEGF除能促进血管内皮细胞增殖和迁移外，还能提供给微血管高渗透性，有利于微血管形成。本研究发现，在微血管周围的癌细胞中VEGF蛋白阳性颗粒增多，说明内皮细胞作为肿瘤血管形成因子的效应细胞在血管形成中发挥着重要作用，VEGF是膀胱癌发生和发展过程中一个主要血管生成因子。本研究证实了VEGF与膀胱癌生物学行为关系密切，应用血管生成抑制剂进行辅助治疗和应用VEGF特异性抗体进行阻断性治疗，可能为膀胱癌治疗提供有效的新手段。作者单位：1100

17、42 沈阳，解放军第四六三医院泌尿外科(石岐兴)；中国医科大学第一临床学院泌尿外科(李芳、刘同才、张铭铮、李书章、孙志熙、孔垂泽、李振华)参考文献1Dvorak HF,Brown LF,Detmar M,et al.Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor,microvascular hyperpermeability and angiogenesis.Am J Pathal,1995,1461029-1039.2Ferrara N,Henzel WJ.Pituitary follicular cell se

18、crete a novel heparin-binding growth factor specific for vascular endothelial.Biochem Biophys Res Commun,1989,161851-858.3Kim KJ,Li B,Winer J,et al.Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo.Nature,1993,362841-844.4彭文鸿.血管内皮细胞生长因子的研究进展.国外医学生理

19、、病理科学与临床分册，1995，15173-175.5Brown LF,Berse B,Jackman RW,et al.Increased expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its receptors in kidney and bladder carcinomas.Am J Pathal,1993,1431255-1262.6修波，于昕，李惠芳，等.某些肿瘤组织中血管内皮生长因子基因的表达.生物化学与生物物理进展，1994，21426-429.7Weidne

20、r N,Semple JP,Welch WR,et al.Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma.N Engl J Med,1991,3241-8.8Weidner N,Carroll PR,Flax J,et al.Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma.Am J Pathol,1993,143401-409.9Dickinson AJ,Fox SB,Persad RA,et al.Quantification of angiogenesis as an independent predictor of prognosis in invasive bladder carcinomas.