广西地方标准《天然牛磺酸与人工合成牛磺酸的鉴别稳定同位素质谱法》编制说明

1、.广西壮族自治区地方标准鉴别天然牛磺酸和合成牛磺酸的检测方法 稳定同位素质谱法（征求意见稿）编制说明一、任务来源广西壮族自治区科学技术厅，广西科学研究与技术开发计划项目，桂科攻0537009-1。广西壮族自治区质量技术监督局，2007年第二批广西地方标准制定计划，桂质监2007210号文（2007年3月）。二、项目背景与制定本标准的目的 牛磺酸（Taurine）又名牛胆酸、牛胆素、其化学名为2-氨基乙磺酸（H2N-CH2-CH2-SO3H），是一种含硫的非蛋白质结构氨基酸。研究表明牛磺酸具有广泛的生物学功能，不仅参与维持体内的环境稳态，而且在中枢神经、消化系统、生殖系统、心血管、免疫和内分泌等

2、系统对生理功能正常发挥具有重要的调节作用。由于人体只能有限地合成牛磺酸，因此，膳食中的牛磺酸就显得非常重要。珍珠贝肉中含有丰富的牛磺酸，广西是南珠的主要产地，每年采珠后珍珠贝肉作为下脚料丢弃，对广西沿海滩涂环境造成污染。北海源龙珍珠有限责任公司发明了酶法从海水珍珠贝肉中提取天然牛磺酸的工艺技术并实现产业化生产，既保护了环境又突破了天然牛磺酸产业化生产技术难题，为药品、保健食品市场提供纯天然牛磺酸产品。由于天然牛磺酸来源于自然生物体，对人体健康几乎是无害的，而合成牛磺酸由于其化学中间产物潜在危害着人体健康，天然牛磺酸市场价格高出合成牛磺酸约100倍，一些不法商贩以合成牛磺酸冒充天然牛磺酸，谋取暴

3、利，目前技术中尚未有鉴别天然牛磺酸和合成牛磺酸的方法和质量体系，因此天然牛磺酸市场遭受严重干扰和不正当竞争。本项目为了支持广西优势资源产业的发展，保护海洋环境，监管销售市场，研究一种能够鉴别天然牛磺酸和合成牛磺酸的检测方法，开展鉴别天然牛磺酸与合成牛磺酸分析测试方法和技术标准研究，建立鉴别技术标准，制定广西地方标准，具有重大的实际意义和学术价值。三 、制定本标准的工作简况项目承担单位：广西壮族自治区分析测试研究中心、北海市源龙生物科技有限公司。标准起草单位：广西壮族自治区分析测试研究中心、北海市源龙生物科技有限公司。标准主要起草人：莫建光、卢安根、陈秋虹、黄艳、石子聪、黄岛平、徐慧、劳燕文。主

4、要工作过程：1.本标准编写依据认真学习中华人民共和国标准法、标准化工作导则、标准制定和产品标准编写规定等相关文件资料，研究确定标准的编写原则和项目的实施方案。参照有关国家标准、行业标准，并根据本产品的特点而制定标准。力求标准的各项指标均符合国家相关标准的规定，各项指标的试验方法引用国家相关标准中规定的方法，引用国家标准、行业标准，并参照执行。2.高纯度天然牛磺酸试样的制备采集了北部湾海域珍珠贝肉、东海贝肉、黄海贝肉和渤海贝肉，按如下技术路线提取高纯度天然牛磺酸单体。贝肉 匀浆 调pH值 酶解 超声浸提 浸提液灭酶 过滤 沉淀蛋白质 离心分离 脱色 树脂吸附纯化 洗脱 真空浓缩 析出结晶 离心分

5、离 二次 纯化 析出结晶 离心分离 干燥处理 高纯度牛磺酸单体 制备获得牛磺酸晶体2#（珍珠贝牛磺酸，北部湾-北海）、3#（珍珠贝牛磺酸，北部湾-北海）、16#（牡蛎牛磺酸，东海-厦门）、17#（贝肉牛磺酸，黄海-青岛）、18#（贝肉牛磺酸，黄海-青岛）、19#（蓝贝牛磺酸，渤海-大连）、20#（文蛤牛磺酸，东海-厦门）、3. 合成牛磺酸试样的选择 （1）合成牛磺酸标准品（批号：T0625-10G），含量：99.8%，美国Sigma公司，编记号为1#(1)；（2）合成牛磺酸标准品（BR，批号：70808），含量：99%，上海生物化学试剂公司，编记号为1#(2)；（3）合成牛磺酸纯品(批号:08

6、09226)，含量：99%，湖北黄冈市富驰公司, 编记号为1#(3)；（4）合成牛磺酸纯品(批号:0809227)，含量：99%，湖北黄冈市富驰公司, 编记号为1#(4)。4.试样结构确证及纯度分析 4.1 红外光谱分析 分别取1#(1)、1#(2)、1#(3)、1#(4)、2#、3#、16#、17#、18#、19#、20#试样适量，溴化钾压片，按中华人民共和国药典（2010年版二部）附录IVC 红外分光光度法测定试样的红外光吸收图谱，试样的红外光吸收图谱应与牛磺酸标准红外光吸收图谱（光谱集44图）对照一致。4.2 纯度分析分别取1#(1)、1#(2)、1#(3)、1#(4)、2#、3#、16

7、#、17#、18#、19#、20#试样适量制成上机液，用氨基酸分析仪检测牛磺酸含量，其含量分别为99.8%、99.2%、99.3%、99.5%、98.5%、99.1%、82.9%、91.5%、89.5%、79.8%、90.2% 。5. 检测方法研究对鉴别天然牛磺酸与合成牛磺酸的检测方法同位素质谱法进行系统研究，其中包括检测条件研究、方法学研究、天然牛磺酸C同位素、N同位素、S同位素比值与合成牛磺酸C同位素、N同位素、S同位素比值的聚类分析研究、天然牛磺酸同位素比值与合成牛磺酸同位素比值结果判定阈值的设定，掺伪试验研究、实验室之间的方法验证等。5.1 同位素质谱法分析条件同位素质谱仪的预调确认同

8、位素质谱仪工作环境、气密性、离子室的真空度均符合要求，然后检验同位素质谱仪的稳定性和峰型，必要时调整离子源参数值。确认数据采集系统设置正确，必要时进行调整。分析参数设定EA参数：氧化炉：10001060，还原炉：630680，柱温：3595，载气（氦气）压力：100kPa 。质谱参数：质普分析室真空（连续流模式）：1.52.0´10-6mbar。C分析：加速电压：3528.37 V；萃取电压：67%AV（加速电压的百分比）；H板电压：18.7462 V；Z板电压：20.04 V；阱电流：200 uA；电子能量：100 eV；推板电压：-8 V ；磁体电流：4000 mA。N分析：加速

9、电压：4546.66 V；萃取电压：75%AV（加速电压的百分比）；H板电压：33.9267 V；Z板电压：21.9959 V；阱电流：200 uA；电子能量：100 eV；推板电压：-7 V ；磁体电流：3500mA。S分析：加速电压：2762.94 V(伏特)；萃取电压：65%AV（加速电压的百分比）；H板电压：8.82 V；Z板电压：-46.5436 V；阱电流：200 uA（微安 ）；电子能量：73.5 eV（电子伏特）；推板电压：-8 V；磁体电流：4500 mA（毫安） 5.2 精密度试验分别取1#（1）和2#试样0.11.0mg，按上述5.1分析条件，测定13C、15N、34S比

10、值，连续测定5次，试样的13C、15N、34S值由计算机自动计算给出，计算结果，得出合成牛磺酸1#（1）的RSD%值：13C的 RSD%为 0.30 ，15N的 RSD%为 4.39 ，34S的RSD%为1.35 ，18O的 RSD%为25.84 ，2H的 RSD%为44.76。天然牛磺酸2#的RSD%值：13C的 RSD%为 0.14 ，15N的 RSD%为 1.28 ，34S的RSD%为2.29 ，18O的 RSD%为19.61 ，2H的 RSD%为20.84。表明该方法的13C、15N、34S精密度良好（见表1，表2）。 表1合成牛磺酸1#（1）12345RSD%13C-27.54-27

11、.64-27.76-27.59-27.600.3015N-1.08-1.10-1.11-1.19-1.184.3934S9.7610.069.849.759.96 1.3518O-1.94-4.00-3.50-4.10-3.2425.842H6.5240.6336.4438.3538.0744.76表2天然牛磺酸2#12345RSD%13C-21.63-21.65-21.64-21.66-21.580.1415N10.6510.5410.2910.5610.471.2834S21.6021.9420.8420.9920.912.2918O9.026.066.295.716.5519.612H-

12、15.97-23.63-23.71-28.54-27.7320.825.3重复性试验取同一来源同一批号的合成牛磺酸5份，同一来源同一批号的天然牛磺酸5份，分别按上述5.1分析条件，测定13C、15N、34S比值，计算平均值，RSD%值：合成牛磺酸1#（1）：13C的 RSD%为 0.16 ，15N的 RSD%为 3.84 ，34S的RSD%为1.43 ，18O的 RSD%为27.00 ，2H的 RSD%为45.31 。天然牛磺酸2#的RSD%值：13C的 RSD%为 0.30 ，15N的 RSD%为 2.30 ，34S的RSD%为1.00 ，18O的 RSD%为17.53 ，2H的 RSD%为

13、20.08。表明样品处理过程和测定方法13C、15N、34S均有良好的重现性。表3 合成牛磺酸1#（1） 1 2 3 4 5平均值RSD%13C-27.66-27.68-27.63-27.59-27.58-27.630.1615N-1.14-1.19-1.20-1.17-1.22-1.143.8434S10.159.899.799.829.919.911.4318O-1.72-3.82-3.60-3.75-3.68-3.3127.002H6.3037.7936.9534.4941.1831.3445.31表4天然牛磺酸2# 1 2 3 4 5平均值RSD%13C-21.67-21.60-21.

14、63-21.77-21.69-21.670.3015N10.2510.7510.2110.6610.4510.462.3034S21.4120.9420.9020.9720.9721.041.0018O8.886.076.266.056.836.8217.532H-15.41-24.85-24.50-26.98-26.72-23.6920.08 5.4稳定性试验分别在0M、6M、12M、18M、24M、30M测定合成牛磺酸1#（1）和天然牛磺酸2# 试样的13C、15N、34S比值，合成牛磺酸1#（1）RSD%分别为0.21、2.69、0.93、25.97、46.06。天然牛磺酸2#RSD%分

15、别为0.35、2.34、1.36、18.54、19.82。表明试样在室温下13C、15N、34S比值比较稳定（见表5、表6）。表5合成牛磺酸1#（1） 0 1 2 3 4RSD%13C-27.53-27.58-27.50-27.59-27.650.2115N-1.76-1.72-1.84-1.82-1.802.6934S9.959.769.899.799.960.9318O-1.83-3.91-3.55-3.92-3.4625.972H5.7439.2136.6936.4640.2546.06表6天然牛磺酸2# 0 1 2 3 4RSD%13C-21.52-21.54-21.60-21.63-

16、21.710.3515N9.8410.0210.2110.2910.452.3434S21.5121.4120.9020.9420.991.3618O8.956.066.275.886.6918.542H-15.69-24.24-24.10-27.55-26.6019.825.6 样品测定采集了渤海、黄海、东海、北部湾防城海域、北部湾钦州海域、北部湾北海海域的贝类天然牛磺酸样品16批，采购了美国Sigma公司、上海生物化学试剂公司、湖北黄冈市富驰化工有限公司、 江永安药业股份有限公司的合成牛磺酸4批次，分别测定其13C、15N、34S、18O、2H比值，结果见表7。表7 天然牛磺酸及合成牛磺酸

17、S、N、C、O、H同位素比值检测结果序号 检测项目样品名称34S（)15N（)13C（)18O（)D（)备 注1#（1）合成牛磺酸（含量99.8%）19.95-1.08-27.54-1.835.74产地：美国Sigma批号：T0625-10G29.97-1.04-27.66-3.9139.211#（2）合成牛磺酸（含量99%）39.81-1.18-27.65-3.5536.69BR，批号：70808上海生物化学试剂公司49.79-0.99-27.59-3.9236.461#(3)合成牛磺酸（含量99.8%）59.94-1.75-27.59-3.4640.25产地：美国Sigma批号：T0827

18、-10G69.88-2.80-27.010.646.82#天然牛磺酸（含量98.5%）121.519.89-21.558.95-15.69北海（北部湾）220.9410.65-21.636.06-24.24320.8810.25-21.676.27-24.10420.9810.61-21.715.88-27.55520.9410.46-21.636.69-26.60620.679.30-21.022.5-13.73#天然牛磺酸（含量99.1%）120.386.55-20.659.05-45.13北海（北部湾）220.396.83-20.539.12-43.066#天然牛磺酸（含量93.5%）1

19、19.937.40-20.358.09-38.07北海（北部湾）219.927.34-20.588.22-37.667#天然牛磺酸（含量50.2%）120.178.60-19.347.36-33.21北海（北部湾）220.088.36-19.407.59-34.048#天然牛磺酸（含量78.9%）121.0913.49-19.199.86-26.46北海（北部湾）221.1013.45-19.289.96-26.429#合成牛磺酸（含量99.8%）110.140.19-20.074.4027.20产地：新西兰210.010.31-20.194.2128.4910#天然牛磺酸（含量99.8%）1

20、20.526.82-20.597.05-41.05北海（北部湾）220.606.89-20.566.76-40.6411# 9:1（天:合）118.949.27-22.367.2210.14219.099.38-22.257.0612.0212# 8:2（天:合）116.898.28-22.957.2012.74216.878.33-23.056.8113.1713# 7:3（天:合）115.357.40-23.515.8519.60215.357.25-23.455.6320.9514# 6:4（天:合）113.956.54-23.895.0719.13213.966.61-23.864.5

21、121.19序号 检测项目样品名称34S（)15N（)13C（)18O（)D（)备 注15#5:5（天:合）111.895.41-24.563.3322.16211.885.43-24.553.5123.9216#厦门牡蛎牛磺酸（82.9%）120.056.02-21.957.53-93.25厦门(东海)219.985.99-22.017.30-95.3817#青岛蛤蜊牛磺酸（91.5%）120.4912.91-22.139.25-63.21青岛(黄海)220.5312.90-22.099.03-64.0818#青岛牡蛎牛磺酸（89.5%）120.5513.11-22.009.01-67.57

22、青岛(黄海)220.5313.13-22.038.41-69.6719#大连蓝贝牛磺酸79.8%120.538.56-19.9510.07-38.50大连(渤海)220.508.47-19.9110.12-38.7720#厦门文蛤牛磺酸90.2%121.355.61-21.358.57-65.10厦门(东海)221.305.94-21.418.12-66.7421#合成牛磺酸(黄冈富驰，批号:0809226)99.813.440.79-27.28-1.57-22.54湖北黄冈市富驰23.430.70-27.30-1.62-20.7522#天津蛤蜊牛磺酸90.4%120.638.77-19.87

23、8.09-38.07天津(渤海)220.598.68-20.038.13-38.2623#广西钦州珍珠贝牛磺酸98.5%121.039.32-19.556.69-26.60钦州（北部湾）221.239.23-19.666.88-26.9024#广西钦州珍珠贝牛磺酸99.3%120.7910.09-21.369.09-40.09钦州（北部湾）220.849.88-21.459.32-39.0725#广西防城珍珠贝牛磺酸93.3%119.978.09-19.818.16-37.87防城（北部湾）219.999.25-19.798.30-37.9426#广西防城珍珠贝牛磺酸79.2%120.967.

24、90-20.659.91-26.44防城（北部湾）220.687.89-20.6110.21-27.0327#合成牛磺酸（潜江永安，批号：）97.2%13.430.74-27.29-1.60-21.65潜江永安药业股份有限公司23.510.82-27.32-1.78-21.96表7 天然牛磺酸及合成牛磺酸S、N、C、O、H同位素比值检测结果5.7.聚类分析附注创建的输出23-六月-2012 22时20分32秒注释 输入活动的数据集数据集0过滤器<none>权重<none>拆分文件<none>工作数据文件中的 N 行46缺失值处理对缺失的定义用户定义的缺失值作

25、为缺失数据对待。使用的案例统计是在所使用的变量不带有缺失值的案例基础上进行的。语法CLUSTER 34S 15N 13C /METHOD MEDIAN /MEASURE=SEUCLID /ID=VAR00001 /PRINT SCHEDULE /PLOT DENDROGRAM.资源处理器时间00:00:00.327已用时间00:00:00.343数据集0 案例处理汇总a,b案例有效缺失总计N百分比N百分比N百分比46100.00.046100.0a. 平方 Euclidean 距离 已使用 b. 中值联结中值联结聚类表阶群集组合系数首次出现阶群集下一阶群集 1群集 2群集 1群集 213445

26、.00200422728.002001932526.003001943334.00501952324.00900376810.010001271920.010004282930.011001793346.0114044102122.01200131112.016001412811.0316024131421.032010251414.034110151513.03114029163536.0350017172935.05481630183940.0550027192527.0563242201516.0570032213738.0600036221718.0690028234344.08000

27、352489.09212027251314.10401332263132.115003727839.245241831281741.370220302915.43015038301729.5002817333178.50702734321315.725252035331742.73630036347121.109310393513431.1673223403617371.1753321393723312.1295264138162.25529044397172.947343640407133.712393541417237.6984037434219258.529719434371937.30

28、34142454413349.542389454517356.73744430 从树状图检测号1、2、3、4、5、6、33、34、45、46、57、58的样品是一类。检测号7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56的样品是另一类。5.8.天然牛磺酸同位素比值与合成牛磺酸同位素比值结果判定范围 通过对16批不同海域贝类牛磺酸和4批不同厂商生产的合成牛磺酸，共58份样品测定其

29、C、N、S、O、H同位素比值（），采用Dendrogran Using Average Linkage（Betveen Groups）聚类方法，从树形图上分析得出两类牛磺酸，即1#（1）、1#（2）、1#（3）、21#、27#是一类，称为A类；2#、3#、6#、7#、8#、9#、10#、16#、17#、18#、19#、20#、22#、23#、24#、25#、26#是另一类，称为B类。从表7中可知A类为合成牛磺酸，B类为天然牛磺酸，它们的C、N、S同位素比值范围为：A.合成牛磺酸的同位素比值范围:13C（PDB）为-26.00-28.0015N（Air-N2）为-1.00-3.00 34S（CD

30、T）为8.0011.00B.天然牛磺酸的同位素比值范围:13C（PDB）为-19.00-22.00 15N（Air-N2）为6.0014.00 34S（CDT）为19.0022.00 5.9. 验证经过核工业北京地质研究院分析测试研究中心、中科院环境地球化学国家重点实验室验证结果基本一致，表明方法可行，数据可靠。表9 方法学考察和样品检测验证结果验证项目广西分析测试研究中心中科院环境地球化学国家重点实验室核工业北京地质研究院分析测试研究中心同位素比值测定1#（1）13C -27.5415N -1.7534S 9.9513C -27.6615N -1.0434S 9.9713C -27.0 15

31、N -2.8 34S -2#13C -21.5515N 9.8934S 21.5113C -21.6315N 10.6534S 20.9413C -21.0 15N 9.30 34S -5.10. 掺伪试验研究取天然牛磺酸2#样品、含量为98.5%，合成牛磺酸1#（1）样品、含量为99.8% 。分别精密称取样品2#和1#（1）各8份，配成天然牛磺酸与合成牛磺酸混合样，混合比例为天然牛磺酸：合成牛磺酸9:1，8.5:1.5，8:2、7.5:2.5，7:3，6.5:3.5，6:4，5.5:4.5，5:5，并编号为11#、12#、13#、14#、15#，将混合的样品分别于水中完全溶解后，真空浓缩干燥测定其13C、15N 、34S比值。结果见表10。表10样品号2# :1#（1）13C15N34S11#9:1-22.319.3219.01 12#8:2-23.008.3016.8913#