正交实验法优化紫茎泽兰总黄酮提取的技术创新

1、正交实验法优化紫茎泽兰总黄酮提取的技术创新    紫茎泽兰（Eupatorium adenophorum Spreng）菊科泽兰属植物，因其茎、叶柄呈紫色，故名紫茎泽兰1，是我国危害最为严重的外来入侵物种之一2。紫茎泽兰化学成分分析文献显示，其含倍半萜、甾体、三萜、黄酮、苯丙素酚等类型化合物3-4。近年来，黄酮类化合物因其在保护心血管、抗氧化自由基等方面的功效而受到关注。摸索紫茎泽兰中黄酮的提取工艺，利用紫茎泽兰提取黄酮，原材料经济、易得，亦为紫茎泽兰的防治开辟一条新的途径。杨郭等5研究了紫茎泽兰总黄酮的提取工艺，但没有把影响得率的重要因素之一“提取次数

2、”纳入工艺提取设计之中，本研究将乙醇浓度、提取温度、液料比、提取时间、提取次数作为考察因素优化紫茎泽兰总黄酮提取工艺。1仪器、试剂与材料11主要仪器、试剂721型分光光度计（四川分析仪器厂）、超声波器、旋转蒸发仪、数显恒温水浴锅HH-2型（国华电器有限公司）、远红外恒温干燥箱、赛特路斯电子分析天平BS210S型、XA-1型高速万能粉碎机（银河实验仪器厂）。芦丁标准品；乙醇（分析纯，重庆化学试剂总厂）；10%硝酸铝（分析纯，天津市化学试剂三厂）；5%亚硝酸钠（化学纯，北京化工厂）；1mol/L氢氧化钠（分析纯，天津致远化学试剂公司）。12材料紫茎泽兰总黄酮含量在发育过程中呈不断上升趋势，其在夏季

3、生长旺盛，夏秋之交黄酮含量较高。在九月份采集成熟、肥厚的紫茎泽兰叶片（采至昆明市西南林业大学校园林地）风干备用。在使用前将风干的材料置于恒温干燥箱中，至60烘干，捣碎。2方法采用乙醇浸提法提取紫茎泽兰中黄酮化合物，以芦丁为标准品，制作浓度吸光度标准曲线，可见紫外分光光度计法测定提取液的吸光度，从而计算黄酮得率。通过单因素试验和正交试验，对影响黄酮得率的主要因素进行筛选，从而得到紫茎泽兰中总黄酮的最佳提取工艺。在测定样品吸光度时，加入亚硝酸钠，防止黄酮类化合物被氧化；加入硝酸铝，形成黄酮铝络合物，增强其吸光度；最后，加入氢氧化钠，使其吸收峰红移，利于排除其他物质的干扰。21标准曲线的制作211标

4、准曲线制作方法精密称取芦丁对照品0125g，将其溶解于适量乙醇中，用乙醇定容至100ml，摇匀，精密吸取10ml置25ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得每1ml中含无水芦丁05mg溶液。精密量取对照品溶液1、2、3、4、5ml，分别置于25ml容量瓶中，各加水至5ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟；加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟；加1mol/L氢氧化钾10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟。分光光度法，在510nm波长处测定其吸光度。并以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。212标准曲线及其方程按上述方法操作，测得不同浓度下的吸光度A值，结果见表1。并以

5、吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制出AC标准曲线，见图1。表1标准曲线结果统计表对照品溶液体积（ml）012345芦丁（mg/ml）00000200400600801吸光度0000004100800123016402图1标准曲线芦丁浓度（mg/ml）、芦丁标准液浓度（X）与吸光度（Y）作线性回归，得到标准曲线的回归方程为Y=201X+0001；R2=09995。从该标准曲线方程及其相关系数可以看出，该标准曲线的线性关系良好。22紫茎泽兰中黄酮类化合物得率的测定将1g紫茎泽兰的乙醇浸提液烘干，定容至10ml，再取1ml，分别加入亚硝酸钠、硝酸铝以及氢氧化钠溶液，定容后测其吸光值，计算其黄酮类化合

6、物的得率。其计算公式为E=（Y-0001）/201。式中，Y为测得的吸光度。23正交设计实验因素选择根据文献报道，影响紫茎泽兰得率的因素很多，影响较大的有提取时间、液料比和提取次数， 影响较小的有提取温度、提取浓度。因此，对提取温度和提取浓度作单因素试验，对提取时间、液料比和提取次数做多因素试验。3结果与分析31实验温度对得率影响的试验称取10000+00005g紫茎泽兰干叶子，分别在60、70、80、90的水浴锅中进行回流，时间为05h，液料比为120，次数为1次，趁热过滤。吸取滤液1ml，测定吸光度Y值。结果见下表：表2提取温度对黄酮得率影响结果统计表温度（）吸光度平均值料重6001180

7、11901000160012009998700120012251000470012510002800112012100999880013010002900120011550999990011110000从上图表可以看出，随着温度的升高，黄酮得率随之升高，在70时达到最大值。如果温度过高，会出现其它杂质溶出增多、溶剂消耗过大等负面影响。32乙醇浓度对得率影响的试验称取10000+00005g紫茎泽兰叶，分别用60%、65%、70%、75%、80%、85%的乙醇，在70下提取05小时，趁热过滤。吸取滤液1ml，测定吸光度Y值。表3乙醇浓度对黄酮得率影响结果统计表乙醇浓度（%）重量（g）吸光度601

8、000301226510005013070100010211750999801548009997013685100030122从表3可以看出，随着乙醇浓度的增加，吸光度也随之增加，当乙醇浓度在70%时，吸光度最高，之后，吸光度随乙醇浓度的增高而降低。33正交试验以提取时间、提取次数和液料比为考察因素，以黄酮类化合物的得率为考察指标，选用L9（34）进行正交试验，以考察提取得最佳工艺。各考察因素及其水平见表4。表4正交试验因素及其水平水平液料比（ml/g）时间（h）次数15115120122251253根据上表中的各条件提取，取提取液1ml，测定其吸光度Y，结果见表5：表5正交试验设计及结果统计

9、表液料比（ml/g）时间（h）次数吸光度得率（%）115115101250622151220123061315125301450714201152011105552012301450716201251013306672511530130064825121013106492512520147073均值1013101220130均值2013001330127均值3013601420140极差0006002000134结论各考察因素对黄酮得率的影响程度不同，按其影响     的主次顺序，依次为时间>次数>液料比。所得最佳工艺为：乙醇浓度70%，液料比为151，提取温度为70，提取时间为25h，提取次数为3次。该工艺所用溶剂常用廉价，提取温度较低，产量高，有利于降低能耗，降低成本，最大限度保证产率。参考文献1刘伦辉，等.紫茎泽兰个体生物及生态学特性研究J.生态学报，1989，9（1）：6670.2高志勇，郭秦岭，孙强.紫茎泽兰研究概况J.陕西师范大学学报，2005，33：94.3鲁萍，桑卫国，马克平.外来入侵种紫茎泽兰研究进展与展望J.植物生态学报，2005，29（6）：1029-1037.4闫乾胜，