研究骨碎补总黄酮对大肠杆菌脂多糖诱导的急性肾衰竭

1、研究骨碎补总黄酮对大肠杆菌脂多糖诱导的急性肾衰竭    骨碎补总黄酮对大肠杆菌脂多糖诱导的急性肾衰竭大鼠ICAM -1 基因表达的影响罗颖，蒋文功，崔淑兰（广东药学院，广东广州510006 )【摘要】目的：探究骨碎补总黄酮对大肠杆菌脂多糖（LPS ）诱导的急性肾衰竭大鼠IcAM-1基因表达的影响。方法：将8O 只雄性三月龄的大鼠平均分为四组，其中对照组水灌胃7d 后腹腔注射生理盐水，LPS 组则水灌胃7d 后腹腔注射3Omg / kg 的LPS ，而AFFDR 组用骨碎补总黄酮灌胃，LPS + AF 一FDR 组则先使用骨碎补总黄酮灌胃7d ，然后腹腔注

2、射LPS , 2h 后接着用骨碎补总黄酮灌胃。观察测定并比较各组大鼠血清中的肌配值，同时比较各组大鼠肾脏病理检查结果，观察比较ED 一l 阳性巨噬细胞的浸润，并且采用半定量化的RT 一PCR 方法检测骨碎补总黄酮对肾组织ICAM 一l 基因表达的影响。结果：LPS 可以造成大鼠Scr 的显著升高和肾小管病理改变，而AFFDR 可以有效降低LPS 的上述影响；同时对照组相比，LPS 显著提高了肾组织ED 一l 阳性巨噬细胞浸润以及ICAM 一1 mRNA 的表达，但是LPS + AFFDR 组在这两个指标上又显著低于LPS 组。结论：AFFDR 可以有效降低LPS 对肾小管超微结构造成的病理损害

3、以及大鼠血清肌配的含量，同时还可以对由LPS 诱导的肾组织ED 一l 巨噬细胞浸润和ICAM 一l 的表达产生较强的抑制作用。关键词：骨碎补总黄酮；急性肾衰竭；LPS ; IcAM 一l     急性肾衰竭是一种临床危重症之一，往往是由多种病因导致的急性肾损害，可以在很短时间内造成肾单位调节功能的急剧减退，导致无法维持体液电解质的平衡，且不能正常排泄代谢产物，进一步导致代谢性酸中毒、高血钾以及急性尿毒症等田。ARF 的发病率居高不下，严重威胁着人类健康二另一方面，对于ARF 的发病机理也未完全明确。本文通过观察骨碎补总黄酮预处理对肾衰竭大鼠IcAM 一l 基因表达

4、的影响，同时探讨骨碎补总黄酮对ARF 的保护机制。1 资料与方法1 . 1 材料及分组：选取80 只Wistar 大鼠（APF 级昆明小鼠购于广州中医药大学实验动物中心，生产许可证号：scxK （粤）2005 一0020 ) ，雄性，3 月龄，体重2509 一280 拜，按照随机的原则分为4 组，分别为C ( ) ntr ( ) l 组、LPS 组、AFFDR 组以及LPS + AFFDR 组。骨碎补总黄酮由中华榭撅的根茎加工提取，提取率为1 . 1 % ，总黄酮的含量为75 % ，每克提取物约含生药66 . 69 （由四川省中药研究所提供）；大肠杆菌脂多糖购自美国519 - ma 公司二免疫

5、组化试剂盒、RT 一PCR 试剂盒购自上海碧云天生物有限公司。1 . 2 治疗方法：C ( ) ll r ( ) l 组大鼠，行水灌胃，2 次d ，持续7 , l ，然后行腹腔注射0 . ZmL / 109 的生理盐水，2h 后接着水灌胃二LPS 组大鼠，水灌胃7d , 2 次d ，然后在第7 天灌胃后2h 行腹腔注射30mg / kg 的LPS , 2h 后继续水灌胃；AFFDR 组大鼠，先用gomg 生药kg 的骨碎补总黄酮灌胃7 ( l ，第7 天灌胃后2h 腹腔注射生理盐水，然后2h 后继续行骨碎补总黄酮灌胃2 次二LPS + AF - FDR 组大鼠，先用gomg 生药kg 的骨碎补

6、总黄酮灌胃7d ，第7 天灌胃后2h 腹腔注射生理盐水，然后2h 后腹,腔注射30mg / kg 的LPS , 2h 后继续行骨碎补总黄酮灌胃2 次。1 . 3 观察指标1 . 3 . 1 血肌配：在大鼠行腹腔注射LPS 或者生理盐水24h 后，经腹主动脉采取的血标本离心处理后提取出血清，并且在24h 内测定血清肌配值。1 . 3 . 2 肾小管病理改变：处死各组大鼠，取肾组织，放入福尔马林液中固定，然后放入B ( ) uin 氏液中4 一6h , 再按标准方法制成4 卜m 厚的切片，HE 及PAS 染色后，在光镜下观察。划分为以下四个级别： 坏死：小管已经全部坏死，或者小管基底膜出现破裂二

7、局灶小管坏死：小管基底膜完好无损，但是腔内出现细胞碎片，上皮细胞有坏死迹象，但并未完全坏死二 小管细胞损伤：小管基底膜完好无损，腔内出现微小细胞碎片，但是丧失了刷状缘，导致胞浆溶入了小管腔内二 正常：肾小管细胞、刷状缘以及小管基底膜等均完好无损。根据上述分级，光镜下每张载玻片观察15 一20 个视野，以小管受损的面积占检测面积的百分比来表示小管组织学病变的程度。1 . 3 . 3 ICAM 一1 mRNA 的表达：在四组大鼠经腹腔注射LPs 或者生理盐水5h 后，处死后取50mg 肾组织，按照试剂盒说明书提取RNA , RT 一PCR 测定肾组织ICAM 一1 mRNA 的表达。ICAM 一l

8、 上游引物：5 ' CAC - ccAAGGAccGcAATAG3 ' ( 21 帅），下游引物：5 ' cGAcGccGcTccAGAA 以AccAc3 ' ( 221 ) P ) ，以GAP - DH 作为内参照二逆转录42 反应3Omin ，然后PCR , 条件是94 灭活30min , 94 变性305 , 56 退火305 , 30 次循环后72 延伸10min 乃琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像图像分析系统分析，以ICAM 一1 条带的积分吸光度值（AICAM 一l ）与GAPDN 条带的积分吸光度值AGAPDN 之比代表ICAM 一lmRNA 的表达量。1

9、 . 3 . 4 ED 一l 阳性巨噬细胞免疫组织化学染色：四组大鼠经腹腔注射LPS 或者生理盐水24h 后，处死，然后用hist ( ) 通ear 液把肾组织标本切片脱蜡，用酒精进行水化，用三氮化钠（10 % ）及过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，小牛血清进行封闭，加入单克隆抗体ED 一l , 在室温下置于PBS 湿盒内进行孵育。加入二抗进行孵育，PBS 清洗3 遍后进行DAB 染色，最后用苏木素进行复染，中性树脂封片。在光镜下观察100 个肾小管间质细胞中的ED 一l 阳性巨噬细胞的平均数量。1 . 4 统计学方法：采用SPSS13 . O 统计软件进行统计分析，采用单因素方差分析比较各均数之

10、间的差别，计量资料进行t 检验，以P < 0 . 05 为差异有统计学意义。2 结果2 . 1 四组大鼠血清中阶r 含量比较：结果显示，LPS 组大鼠血清中的阶r 含量显著高于LPs + AFFDR 组和C ( ) lltr ( ) l 组的阮r 含量，差异具有统计学意义（P < 0 . 05 ）二而C ( ) lltr ( ) l 组与AFFDR 组无显著性差异。 Control 组15 71 . 3 士7 . 6 注：* LPS + AFFDR 组与Control 组相比，P < 0 . 05 2 . 2 LPS 组与LPS + AFFDR 组近端小管细胞学结果比较：LP

11、S 组大鼠，肾小管上皮细胞呈现片状变性，刷状边缘紊乱，且见上皮细胞脱落于管腔内，肾小管基底膜部分断裂、裸露，或萎缩状，肾小球形态则无明显改变。LPS + AFFDR 组大鼠针对上述状况表现较轻，肾小管上皮细胞空泡变性减少，仅有个别管腔可见上皮细胞脱落，个别肾小管基底膜部分断裂、裸露，或萎缩状。由于AFFDR 组与C ( ) ntr ( ) l 组大鼠在肾结构上未呈现明显改变，因此本文仅比较LPS 组与LPS + AFFDR 组的情况，见表2 。LPS + AFFDR 组的肾小管受损程度明显低于LPS 组的受损程度，差异具有统计学意义（P < 0 . 05 ）。LPS 组21 . 9 士1

12、4 . 2 37 . 1 士4 . 8 43 . 4 士1 . 7 8 . 1 士3 . 7 LPS + AFFDR 组8 . 9 士4 . 3 20 . 5 士9 . 4 37 . 6 士8 . 9 18 . 9 士8 . 6 注：* LPS + AFFDR 组与LPS 组相比，P < 0 . 05 2 . 3 四组大鼠肾脏ED 一l 阳性细胞数的表达：LPS + AFFDR 组ED 一1 阳性细胞数为（3 . 5 士1 . 3 ）八00 个小管间质细胞显著少于LPs 组（10 . 35 士3 . 1 ) / 100 个小管间质细胞，但是上述两组均高于c ( ) ll tn ) l 组

13、（0 . 35 士0 . 02 ) / 100 个小管间质细胞，差异具有统计学意义（P < 0 . 05 ）。见表3 。2 . 4 对四组大鼠肾组织ICAM 一1 m RNA 表达的影响：AFFDR 组大鼠肾组织ICAM 一1 RNA 表达与C ( ) ll - tr ( ) l 组无明显差异二但是LPS + AFFDR 组的ICAM 一l RNA 表达显著低于LPS 组，同时LPS 组的ICAM 一1 RNA 表达又显著高于C ( ) lltn ) l 组，差异具有统计学意。3 讨论3 . 1 急性肾衰竭：由肾外原因或者是肾脏本身引起肾脏尿功能的急剧下降，导致机体内环境出现了严重紊乱，

14、临床上称为肾衰竭，主要症状为无尿或者少尿、高钾血症、氮质血症以及代谢酸中毒等喇。表现为电解质平衡紊乱、急性循环衰竭、严重失水、失血、休克等闻。其中肾小管坏死是最为常见的致病原因，特征明显，同时肾前性衰竭的持续发展也会转化为急性肾小管的坏死。而引起急性肾小管坏死的病因多种多样，可概括为以下两大类： 肾中毒：如药物磺胺、四氯化碳、二氯磺胺（, 11 ：hl ( ) rphenami , le ) ；抗生素如新霉素、二性霉素B 、碘造影剂、甲氧氟烷麻醉剂等二生物毒素如蛇毒、斑鳌素（Canthari （五n ）等，都可在一定条件下引起急性肾小管坏死。 肾缺血：严重的肾缺血如重度外伤、大面积烧伤、大手术

15、、重症感染、败血症、脱水和电解质平衡失调，特别是合并休克者，均易导致急性肾小管坏死。内毒素性急性肾衰竭亦是感染性休克患者死亡的原因之一，目前临床仍旧缺乏有效的药物进行治疗。本研究中，注射LPS 后出现肾功能恶化显示成功诱导急性肾衰竭动物模型，表现为血肌配升高，且肾组织出现肾小管坏死等病理特征。同时我们的研究结果提示骨碎补总黄酮可以减轻由LPS 引起的肾衰竭，还能降低LPS 攻击大鼠血清肌配含量，说明骨碎补总黄酮可以有效的预防内毒性肾衰竭并保护肾组织。3 . 2 骨碎补总黄酮保护急性肾衰竭的机制：传统中药骨碎补总黄酮在肾脏疾病的防治中有其优势，骨碎补药用部分为水龙骨科植物榭蔗或中华榭蔗的根茎而骨

16、碎补总黄酮是由其干燥根茎中提取的，是骨碎补主要有效成分。本实验发现，骨碎补总黄酮既能显著降低LPS 诱导的大鼠血清肌配含量，又可以显著减轻LPS 对肾小管超微结构造成的病理改变，这表明骨碎补总黄酮可以防止LPS 引起的肾功能障碍，并对肾组织产生一定保护作用。其机制可能如下： LPS 是引起休克和炎症反应的重要介质，而正常生理情况下，肾组织的ICAM 一1 表达水平较低，但是注射LPS 后，它会诱导内皮细胞ICAM 一l 的表达，而ICAM 一l 是导致炎症I 性细胞向肾间质组织浸润的主要分子，是肾脏炎症活动的主要标志，当发生急性肾衰竭时，肾组织会高表达ICAM 一l 。本研究显示，注射了LPS 的大鼠，血肌配显著升高，且肾组织出现肾小管坏死，但注射骨碎补总黄酮后，肾组织ICAM 一1 mRNA 的表达明显下降，这提示骨碎补总黄酮通过下调ICAM 一1 的表达保护内毒对肾脏损害。骨碎补总黄酮通过何种途径降低肾组织ICI - AM 一l 的表达，目前还不清楚，可能与抑制组织细胞或血清TNF 一。和IL 一6 的分泌，或抑制肾组织的氧化应激反应有关，尚待进一步研究。 早期急性肾衰竭发生的重要病理生理改变常表现为巨噬细胞在肾组织的浸润和激活。这些被激活的巨噬细胞，一方面对肾小球内皮细胞核小管上皮细胞